히스톤 탈아세틸화 저해제인 sodium butyrate (NaB)를 사용한 인간 배아줄기세포의 배양 = culture of human embryonic stem cell using sodium butyrate (NaB), a histone deacetylase inhibitor

국문 초록 (Abstract)

인간 배아줄기세포(hESC)는 인간배아에서 기원한 세포로 무한히 분열할 수 있는 self renewal한 특성과 인체의 모든 조직(three germ layer)으로 분화할 수 있는 pluripotency한 능력을 가지고 있다. 이러한 특성으로 미래 세포치료제로서의 가능성을 가지고 연구가 진행되고 있다. 세포치료제로의 이용을 위하여 안정적이며 임상적용 가능한 다량의 미분화 hESC를 배양 할수 있는 기술이 필요하고, 이 후 원하는 시기에 원하는 방향으로의 분화를 유도 할 수 있는 기술 또한 요구되어진다. hESC를 배양은 전통적인 방법으로 mouse embryonic fibroblast (MEF)와 같은 동물유래 지지세포를 위에 basic FGF (bFGF, FGF2)를 처리한 배양배지를 사용하여 미분화를 유지하는 방법이 가장 대표적이다. 최근 들어서 많은 연구에선 serum을 제거하고 그를 대체할 수 있는 KnockOut Serum replacer와 함께 bFGF의 농도를 조절하거나 다양한 조건들을 조절하여 animal contamination 없이 hESC와 iPSC (induced pluripotent stem cells, 유도만능줄기세포)를 배양할 수 있는 배양배지를 개발하는 연구를 진행하고 있다. 이와 같은 목표를 가지고 본 연구에서는 hESC의 특성을 유지하는데 histone modifications이나 DNA methylation이 중요한 조절자로 역할 한다는 사실을 필두로 histon deacetyration inhibitor인 sodium butyrate를 처리하여 hESC를 배양할 시 어떠한 영향을 주며 지속적인 계대배양에 있어서도 안전하게 배양이 가능한지 평가하였다. 우리는 0.2mM sodium butyrate 배양배지에서 가장 효율적으로 hESC를 배양할 수 있었으며 20passage이상 계대 배양이 가능하였으며 동결과 해동 후에도 정상적으로 미분화 상태를 유지하며 배양이 가능하였다. 점착률과 성장속도에 있어서도 큰 이구 없이 배양되어 안정적인 배양조건으로 판단되어지며 배양된 hESC는 단백질 면역형광염색과 유전자발현 수준에서도 다양한 미분화 특이적 요소들을 발현하였다. 또한 지속적으로 계대 배양을 진행한 후에도 hESC의 정상적인 핵형을 확인함으로써 sodium butyrate처리를 이용한 배양이 hESC를 안정적으로 배양하는 방법으로 적합하다는 것을 확인 하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Human embryonic stem cells (hESCs) are mostly derived from the inner cell mass of the blastocyst and possess the ability to self-renew and differentiate into all the cells composing our body. These properties make hESCs a promising cell source for future cell replacement therapy. In order to use hESCs for clinical purposes, several issues have to be resolved such as avoidance of the xenogen contamination, prevention of tumor formation and efficient differentiation of the hESCs into a specific cell type of interest. Conventionally, hESCs has been cultured on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells in the medium containing knockout serum replacer (KSR) and basic fibroblast growth factor (bFGF). Several efforts have been made to develop more efficient media that could support undifferentiated growth of hESCs. Most of these developments have been taking advantage of the signaling pathways critically involved in self-renewal of hESCs. In this study, we tried to evaluate a method to culture hESCs by regulating epigenetic status using a histone deacetylase inhibitor, sodium butyrate (NaB). In our study, 0.2 mM of NaB could efficiently support undifferentiated growth of hESCs more than 20 passages. The hESCs cultured in the NaB-based medium were shown to express typical undifferentiated markers when analyzed by immunostaining and RT-PCR experiments. Finally, hESCs maintained for more than 20 passages displayed normal karyotype. Cumulatively, our results indicate that epigenetic regulators such as NaB could be used to culture hESCs by replacing otherwise essential growth factors such as bFGF. This study would provide useful information which might be translated into culturing hESCs for future clinical applications.

Keywords : Human embryonic stem cell, Sodium butyrate, NaB, histone deacetylase inhibitor

목차 (Table of Contents)

• I.서론 1
• II. 재료 및 방법 3
• 1. NaB를 이용한 인간 배아줄기세포의 배양 3
• 2. 미분화 마커들의 형광면역염색 (immunostaining) 3
• 3. RT-PCR과 qRT-PCR을 이용한 유전자 발현 분석 방법 4
• 4. Colony 크기와 MEF 지지세포에의 부착율 (attachment rate) 측정 6
• 5. Western blot 6
• 6. 핵형 분석 7
• III. 결과 및 고찰 8
• 1. NaB를 이용한 인간 배아줄기세포의 배양 8
• 2. bFGF를 포함하는 배지와 NaB를 포함하는 배지에서 배양된 인간 배 아줄기세포의 비교분석 10
• 3. NaB를 첨가한 배지에서 배양된 인간 배아줄기세포에서의 여러 미분화 마커들과 분화 마커들의 발현여부 조사 12
• 4. ERK1/2의 인산화 정도 비교 17
• 5. 핵형 분석 19
• IV. 결론 21
• 참고문헌 22
• 영문요약 25