돼지 수정란에 있어서의 sperm-mediated을 이용한 유전자 전이에 관한 연구 = Studies on the Sperm-mediated Gene Transfer into Porcine Oocyte

국문 초록 (Abstract)

한글초록:현재까지 외래 유전자를 도입하여 형질전환 동물을 생산하는 방법은 다양하게 연구되어 왔다. 본 연구는 난자의 세포질 내 정자 직접 주입법을 이용한 형질 전환 돼지 생산 기법을 개발하기 위하여 수행하였다. 신선정자의 두부로부터 외부 세포막을 분리하기 위해 0.05% Triton X-100을 이용 하였으며, 그리고 정자세포와 DNA의 결합을 유도하기 위해 Lipofectin/DNA complex을 이용하였다. Triton X-100을 처리한 군은 정자와 pCX-EGFP/Neo 유전자의 결합을 유도 한 후 난자 내에 정자을 직접 주입하였으며, Lipofectin/DNA complex을 처리한 군은 pCX-EGFP/Neo을 정자와 함께 17℃에서 6시간 공배양 후 난자 내에 정자를 직접 주입하였다. 난자의 활성화를 유도하기 위해 전기적인 처리와 화학적 처리를 이용하였다. 활성화 처리된 난자의 발달율은 calcium ionophore을 이용한 화학적 처리방법 (36.0%)이 전기적 처리 방법 (28.9%) 보다 다소 높은 결과를 나타냈지만 통계적 차이는 없었다. 미세 주입된 난자에서의 Lipofectin/DNA complex을 처리군과 Triton X-100 처리군의 발달율 및 GFP 발현에 있어서는 서로간의 유의적 차이는 없었다. 배반포의 세포자연사는 Triton X-100군이 돼지 체내 수정란보다 유의하게 높았으나 다른 처리군들간에는 유의차를 보이지 않았다. ICM 과 TE 세포를 조사한 결과는 돼지 체내 수정란과 처리군간에 유의차는 보이지 않았다. GFP 발현 모양 에서는 배반포에서의 전체적인 발현에 있어서 Lipofectin/DNA complex을 처리한 군이 Triton X-100을 처리군에 비해 높게 나타났다. 이는 Lipofectin/DNA complex을 처리한 군이 Triton X-100 처리군에 비해 난자 세포질내에 DNA가 더 안정적으로 결합하여 진다고 사료 되어진다. 돼지에게 이식후 5, 7 그리고 15일째의 GFP 발현을 관찰하였고 특히 15일째에는 elongated blastocyst을 얻을수 있었으며 elongated blastocyst을 7일 이상 cell culture한 결과 GFP발현이 유지되고 있음을 확인 할수 있었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 정자직접 주입법을 이용한 형질전환 수정란 생산시에 정자내에 유전자를 도입하는 방법의 개선을 통하여 형질전환 수정란 생산 효율을 증진 시킬 수 있을 것으로 사료 되어진다. 그리고 이상의 결과를 기초로 하여 보다 심도있는 연구가 진행된다면 형질전환 동물 생산에 기여할 것으로 사료되어진다

국문 초록 (Abstract)

영문초록:Transgenic animals had been produced in mice primarily by microinjecting exogenous DNA into male pronuclei of a zygote. The method is not efficient in farm animals, limiting it is general utility such as a large-scale facility. In our study, the exogenous DNA using sperm was delivered into the cytoplasm of porcine zygote, to evaluate in vitro and in vivo development of porcine intracytoplasm sperm injection (ICSI) oocytes and the possibility of producing transgenic embryos and offspring to introduced green fluorescence protein (GFP) gene. For DNA binding to sperm heads, Lipofectin/DNA complex and 0.05% Triton X-100 were used and all cultured embryos was artificial activated with calcium ionophore or electrical stimulate. GFP expression, apoptosis rate and cell numbers in porcine embryos after injection of spermatozoa carrying with GFP DNA fragment were investigated. The blastocyst rate in the chemical or electrical activated groups was significantly higher than that in the non-activated group. After injection of the sperm binding DNA with Lipofectin/DNA complex or Triton X-100 triturate, the blastocyst formation rates on day 7 were no difference to compare the ICSI only group (18.8, 19.2 and 25.3%). GFP expression rate in two different DNA binding groups, Triton X-100 group was higher (40.6%) than Lipofectin/DNA complex group (36.4%), but GFP whole expression rate as no mosaic in blastocyst embryos was higher (P < 0.05) in Lipofectin/DNA complex group (4.2%) than Triton X-100 group (0.9%). On the other hand, to investigate the sperm treatment and injection damages in in vitro developed blastocyst after ICSI, the trophectoderm (TE), inner cell mass (ICM) and apoptosis cell numbers were counted by differential staining and TUNEL assay. The ratio of apoptosis to total cells in Triton X-100 treated group was higher than Lipofectin/DNA complex, ICSI only and in vivo-derived embryos groups, whereas cell number of TE and ICM was similar. ICSI embryos derived from sperm treated with Lipofectin/DNA complex were transferred into 3 recipient and were collected by uterine flushing on day 5, 7 and 15 after embryos transfer, and then GFP expression was observed by a fluorescence microscopy. Elongated embryos on day 15 were cultured in DMEM medium containing 20% fetal bovine serum and GFP gene expression was not disappeared for 1 or 7 day. The results suggest that GFP gene transfer with DNA bound to sperm heads should be application to produce transgenic embryos and offspring, and provide an efficient procedure for studies involving large animal models