Development of Gene Amplification-Based Expression System for High-Production Recombinant Proteins in Animal Cell = 신규 유전자증폭 기반 재조합 단백질 고생산성 동물세포용 발현시스템 개발

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Animal cell culture technology is a technique used for the production of therapeutic proteins, antibodies, and pharmaceuticals. Currently, there is a continuous increase in demand for recombinant protein therapeutics produced in mammalian cell in the biopharmaceutical market. Among these, Chinese hamster ovary (CHO) cells are widely utilized as the primary cell for commercial production of therapeutic proteins. CHO cell offer the advantage of being capable of suspension culture, making them suitable for large-scale production of recombinant proteins. Additionally, the technology for efficient gene amplification systems and high-expression cell line selection is well-established in CHO cell. While using animal cells for expression systems has various advantages, it also has the drawback of lower productivity compared to microbial systems. Furthermore, the development of techniques for large-scale protein production in cells has traditionally been based on information from the cell's genome, transcriptome, proteome, and metabolome. Particularly, at the genomic level, the technology for amplifying target genes, which can be considered as the starting point for protein production, has traditionally involved codon deoptimization of the host cell and the use of selection markers with high selective pressure. To meet the high demand for biopharmaceuticals, it is essential to quickly obtain high-productivity cells with low levels of selective pressure in a short time. However, the existing gene amplification systems, such as PEST codon deoptimization and selection marker genes, suffer from the challenge of requiring high selective pressure and an extended duration to enhance productivity. In addition, if the production period is prolonged, the stability of the cell genome can decrease, potentially impacting the productivity of the target protein. Therefore, in this research, efforts were made to establish a new amplification system for the production of target proteins in cell. As a result, the degron sequences, when compared to known gene amplification systems, were found to have a high degradation capacity and relatively short sequences, reducing the likelihood of causing structural issues with the target protein. These degron sequences were fused to selection marker genes, which were used to produce the target protein. Cell transfection was employed for the generation and selection of cells that produce the target protein through electroporation. This approach aimed to establish efficient expression vectors for high-productivity cell line development. Among various Degron sequences, including UbR, UbK, and UbS, which exhibit different levels of degradation strength, we fused each of them to the upstream region of the nutritional marker gene DHFR. This fusion was carried out to co-express these Degron sequences with the target protein, human transforming growth factor-beta Ⅰ (hTGF-β1). To facilitate this co-expression, the IRESatt sequence was inserted between the expression cassette for hTGF-β1 and the expression cassette for DHFR. Using the engineered marker, we selected the cell line with the highest expression as determined by ELISA among the transfected cell lines, and then proceeded with a clone selection process through limiting dilution. This study provides insights into the development of high-productivity cell lines and the selection process, including the use of degron sequences fused to upper selection marker genes for gene amplification mechanisms and production analysis through recombinant vectors and transfected cell.

국문 초록 (Abstract)

동물세포배양기술은 치료용 단백질이나 항체 및 의약품의 생산들에 쓰이는 기술이다. 현재 바이오 의약품 시장에서 포유류 세포에서 생산되는 재조합 단백질 치료제에 대한 수요가 지속적으로 증가하고 있다. 그 중 Chinese hamster ovary (CHO) 세포가 치료용 단백질의 상업적인 생산을 위한 주요 세포로 이용되고 CHO 세포는 부유배양이 가능해 재조합 단백질의 대량 생산에 용이하며, 효율적인 유전자 증폭시스템과 고 발현 세포주 선별에 대한 기술이 잘 밝혀져 있다는 장점이 있기 때문이다. 세포주 개발에는 CHOpro3-로부터 DHFR 유전자가 모두 결손 된 CHO-DG44 (DHFR-/-) 세포주가 일반적 으로 널리 사용되고 대신 되고 있는데 이러한 동물세포를 이용한 발현시스템에는 여러 가지 장점이 있지만 미생물에 비해 생산성이 낮다는 단점도 있다. 또한 세포에서 목적 단백질을 대량으로 생산하는 기술 개발은 세포 내 유전체, 전사체, 단백체, 대사체의 정 보를 기반으로 이루어져 왔다. 특히, 단백질 생산의 시작이라 할 수 있는 유전체 수준에 서 목적유전자의 증폭 기술은 분해서열과 선별마커유전자의 코돈 비최적화가 전통적으 로 사용되고 있다. 최근 바이오 의약품에 대한 높은 수요에 대응하기 위해서는 낮은 농 도의 선택압으로 단기간에 고생산능 세포를 확보하는 것이 중요하다. 그러나 기존에 사 용하는 유전자증폭시스템인 PEST 분해서열과 선별마커 유전자의 코돈 탈최적화는 생산 성을 높이는데 높은 농도의 선택압과 오랜 시간이 걸린다는 문제점을 가지고 있다. 그 리고 제작기간이 오래 걸리면 세포 유전체의 안정성이 감소하여 목적단백질의 생산성에 영향을 끼칠 수 있다. 이에, 본 연구에서는 세포에서 목적단백질 생산을 위한 새로운 증 폭 시스템을 구축하고자 노력한 결과, 분해서열 Degron은 기존에 알려진 유전자증폭시 스템과 비교하여 분해능이 높고 비교적 짧은 서열을 가지고 있어 목적단백질의 구조적 인 문제를 야기할 가능성이 낮아 Degron 서열을 선택 마커 유전자에 융합하였다. 세포 형질감염은 목적단백질을 생산하는 세포를 전기침공법으로 생성 후 선별하는데 사용함 으로써, 고생산능 세포주 개발을 통해 세포주개발 기술을 구축하고 세포주 개발에 있어 서 효율적인 발현벡터를 사용하여 고생산능 세포주를 얻는 과정을 확립하고자 하였다. Degron의 여러 서열 중에서 분해강도가 상, 중, 하의 세기를 갖는 UbR, UbK, UbS를 각 각 영양요구성마커 유전자 DHFR의 상위에 융합하여 목적단백질로 생산하는 인간전환성 장인자(hTGF-β1)와 함께 발현하기 위해 IRESatt를 hTGF-β1 발현 카세트와 DHFR 발현 카세트 사이에 삽입하였다. 융합된 마커를 통해 형질감염한 세포주 중 가장 높게 발현 되는 마커를 선택하였고 제한희석을 통해 Clone 선별과정을 진행하였다. 본 연구는 분 해서열 Degron을 영양요구성마커 유전자의 상위에 융합하여 유전자 증폭기작을 통해 목적 단백질의 생산성을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질감염된 세포 를 통한 생산량 분석을 통해 고생산성 세포주 개발 및 선별과정을 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract 3
• Table of Contents 5
• List of Figures 7
• 1. Introduction 9
• 2. Materials and Methods 12
• 2.1 Vector Engineering 12
• 2.2 Cell Culture 12
• 2.3 Transfection 13
• 2.4 Cell Analysis 13
• 3. Results 16
• 3.1 Minipool Screening 16
• 3.2 hTGF-β1 transfection과 sequential selection 19
• 3.3 Limit Dilution and Clone Selection 22
• 3.4 Clone Batch Culture and Analysis 24
• 4. Conclusion and Discussion 28
• 5. References 29