α-tocopherol 이 인간지방조직에서 유래된 중간엽 줄기세포에 미치는 영향 = Effect of a-tocopherol on Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells(ATMSCs) Cultured in vitro

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The present experiment was performed to evaluate antioxidant effect of ɑ-tocopherol on human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells(ATMSCs) in vitro.
Reactive oxygen speices(ROS) was induced by damaging agent, 600μM H2O2. Viability of ATMSCs was compared with ɑ-tocopherol treatment group and ascorbic acid treatment group or coumarin treatment group in DMEM-L medium with 600μM H2O2. Cell viability was evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay and cell proliferation was measured by hemocytometer. ATMSCs were cultured in osteogenic induction medium(OI) treated with ɑ-tocopherol, ascorbic acid and coumarin in vitro, and then cell differentiation was evaluated by p-nitrophenol method and 1,9-dimethylmethylene blue(DMMB) assay.
The results were as follows ;
Cell viability in DMEM-L medium group treated together with 150μM ɑ-tocopherol and 600μM H2O2 was higher than in the group cultured for 12 hours in DMEM-L medium with 150μM ɑ-tocopherol before treatment of 600μM H2O2. And, ɑ-tocopherol treatment group had higher viability than ascorbic acid treatment group or coumarin treatment group. Many cells showed typical form in ɑ-tocopherol and H2O2 treatment group, but only H2O2 treatment group showed cell apoptosis and trasformed cell membrane.
Cell proliferation of ATMSCs in ɑ-tocopherol treatment group was increased higher than in control group from 3 days to 14days.
Alkaline phosphatase(ALP) activity of ATMSCs in OI group and in OI medium treated with 150μM ɑ-tocopherol group gradually increased to 7 days but rapidly increased after 14 days. ALP activity of ATMSCs in OI medium treated with ɑ-tocopherol group showed lower value than in OI group during 21 days. ALP activity of ATMSCs in OI medium treated with ascorbic acid group or in OI medium treated with coumarin group overally showed lower value than in OI group, and OI medium treated with ɑ-tocopherol group showed lowest ALP activity on 21 days. Glycosaminoglycan(GAG) synthesis of ATMSCs in ascorbic acid treatment group showed higher value than in OI group.
The results demonstrated that ɑ-tocopherol had high cell protection effect to damage by ROS, and it had higher effect than other antioxidants, ascorbic acid and coumarin. ATMSCs had higher proliferation rate in ɑ-tocopherol treatment group than in control group. In this study, ɑ-tocopherol may be considered to effective proliferation factor of ATMSCs in vitro. Although ALP activity of ATMSCs in ɑ-tocopherol treatment group showed lower value than in control group, ALP activity continuously increased during culture period. ɑ-Tocopherol may be considered to not inhibiting cell differentiation to osteoblast but delaying it.

국문 초록 (Abstract)

본 실험은 ɑ-tocopherol이 체외 배양에서 인간지방 조직 유래 중간엽 줄기세포(ATMSCs)에 미치는 항산화 효과와 골분화에 미치는 영향을 알아보고자 수행하였다.
ATMSCs의 화학적 스트레스에 대한 항산화 기능을 알아보기 위하여, 활성산소의 발생은 600μM H2O2를 첨가하여 처리하였고, 150μM ɑ-tocopherol의 처리시간에 따라 생존률을 측정하였다. 그리고, 잘 알려진 항산화제인 ascorbic acid 및 coumarin을 처리하여 화학적 스트레스에 대한 항산화적 기능을 생존률을 통하여 비교하였다. 또한, ɑ-tocopherol을 첨가하여 증식률을 비교하였다. 세포의 생존률과 증식률은 각각 MTT assay와 hemocytometer를 사용하여 측정하였다.
ATMSCs의 골 분화에 미치는 ɑ-tocopherol의 영향을 알아보기 위하여 alkaline phosphatase(ALP) 활성과 glycosaminoglycan(GAG) 합성정도를 21일 동안 배양하면서 측정하였다. 또한, ascorbic acid 및 courmarin을 첨가하여 ɑ-tocopherol의 영향과 비교 하였다. 골 형성은 p-nitrophenol method와 1,9-dimethylmethylene blue(DMMB) assay를 이용하여 확인하였다.
결과는 다음과 같다 ;
활성산소에 대한 생존률은 150μM ɑ-tocopherol을 첨가하여 12시간동안 체외배양한 후 600μM H2O2를 처리한 군보다 ɑ-tocopherol과 600μM H2O2를 동시에 처리한 군에서 더 높게 나타났다. 또한, 다른 항산화제인 ascorbic acid 및 coumarin이 첨가된 군보다 ɑ-tocopherol이 첨가된 군이 더 높은 생존률을 나타내었다. 600μM H2O2에 의한 화학적 손상으로 인해 세포막이 변형되고 세포가 사멸 되었지만 ɑ-tocopherol이 첨가된 군에서는 많은 수의 세포가 정상적인 형태를 유지하고 있는 것이 확인 되었다.
ATMSCs의 세포증식률은 ɑ-tocopherol첨가된 군에서 3일 째부터 대조군보다 높게 나타났으며, 14일 까지도 ɑ-tocopherol이 첨가된 군이 대조군보다 높은 증식률을 나타내었다.
Osteogenic induction(OI) 배양액군과 150μM　ɑ-tocopherol이 첨가된 OI배양액군에서의 ALP활성은 세포 배양 7일까지는 모든 군에서 완만한 증가율을 보이다가 14일째부터는 급격히 증가하였다. 그러나, 배양 기간동안 ɑ-tocopherol이 첨가된 OI배양액군은 기본 OI배양액보다 낮은 ALP활성을 나타내었다. 또한, 다른 항산화제인 ascorbic acid 및 courmarin을 첨가하여 배양 21일에 측정한 결과 전체적으로 대조군에 비해 낮은 ALP활성을 보였으며 ɑ-tocopherol이 첨가된 군이 제일 낮은 ALP활성을 나타내었다. OI배양군과 항산화제인 ɑ-tocopherol, ascorbic acid, coumarin이 각각 첨가된 OI배양액군에서 배양 21일에 glycosaminoglycan(GAG)측정 결과, ascorbic acid 첨가군에서만 대조군보다 높게 나타났다.
본 실험의 결과들을 종합해 볼 때, ɑ-tocopherol은 활성산소종(ROS)에 의한 손상에 대하여 높은 세포생존 효과를 나타내었고, 다른 항산화제들과 비교하였을 때도 더 높은 효과를 나타내었다. 세포의 증식률을 감소시키는 것으로 알려진 in vivo 실험보고와는 다르게 본 실험의 경우에는 ATMSCs를 사용한 in vitro 실험에서는 ɑ-tocopherol이 첨가된 군이 높은 세포증식 효과를 나타낸 것으로 보아 ɑ-tocopherol의 첨가가 ATMSCs의 효과적인 체외배양 요소로 작용한 것으로 생각된다. 또한, OI배양액군보다 ɑ-tocopherol이 첨가된 OI배양액군이 낮은 ALP를 나타내었지만, 배양시간이 길어질수록 ALP활성이 꾸준히 증가한 것으로 보아 ɑ-tocopherol이 ATMSCs의 osteoblast로의 분화를 억제하기 보다는 분화시기를 지연시키는 것으로 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 실험 재료 및 방법 4
• 1. ATMSCs 세포의 채취 및 배양 4
• 2. ɑ-tocopherol 첨가에 따른 ATMSCs의 생존률 측정 5
• 3. ɑ-tocopherol 첨가에 따른 ATMSCs의 증식률 측정 6
• 4. ɑ-tocopherol 첨가에 따른 ATMSCs의
• alkaline phosphatase(ALP) 활성측정 7
• 5. ɑ-tocopherol 첨가에 따른 glycosaminoglycan(GAG) 함량 측정 8
• 6. 통계처리 8
• Ⅲ. 실험결과 .9
• 1. ɑ-tocopherol의 첨가에 따른 ATMSCs의 생존률 9
• 2. ɑ-tocopherol의 첨가에 따른 ATMSCs의 증식률 13
• 3. ɑ-tocopherol의 첨가에 따른 ATMSCs의
• alkaline phosphatase(ALP) 활성 16
• 4. ɑ-tocopherol 첨가에 따른 glycosaminoglyca(GAG) 함량 19
• Ⅳ. 고 찰 22
• 국 문 요 약 28
• 인 용 문 헌 30