인간면역결핍바이러스 gp41 중화항체의 펩타이드 항원성 및 항펩타이드 항체 생산에 관한 연구 = Studies on antigenicity an anti HIV gp41 neutralizing antibody and production of anti-peptide antibodies

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 AIDS를 일으키는 HIV-1를 억제하기 위한 방안으로 강력한 항 HIV-1활성을 가지는 2F5 hmAb 와 유사한 중화항체를 만들기 위하여 합성 펩타이드를 제조하고, 이를 이용하여 다양한 조건에서 2F5 hmAb 의 항원성을 분석하고, 이것을 토대로 항 펩타이드 항체를 제조함으로써 항원성 및 항 HIV-1활성을 조사, 2F5 hmAb 와 비교하였다.
1. 2F5 hmAb가 인식하는 펩타이드의 항원성은 부착된 상태에서는 펩타이드 서열 및 길이에 따른 항원성의 차이가 적게 나타났으나, 수용액 상에서는 커다란 차이를 나타내었다. 수용액 상에서의 펩타이드 항원성으로 분석한 2F5 hmAb의 펩타이드 항원의 결합은 기존에 2F5 항원결정기라고 알려진 ELDKWA외에도 N-말단 및 C-말단에 주변의 아미노산들이 첨가된 HEQELLELDKWASLWN 서열이 존재할 때 최대로 나타났다. 이 서열에서 N-말단 NEQE 및 C-말단 SLWN이 제거될 경우 수용액 상에서 항원성은 1/10 이하로 나타났으며, 특히 ELDKWA중 E가 없는 P7-M2는 수용액상에서 전혀 항원성이 없었다.
2. 같은 아미노산 서열의 펩타이드들이라도 단가지 및 MAP2, MAP4에 따라 2F5 hmAb에 대한 항원성은 다르게 나타났다. 단가지 펩타이드들 중 길이가 짧은 P5-L은 부착 효율이 매우 낮았으나, 길이가 긴 P2-L은 펩타이드 길이에 따른 차이가 다가지 펩타이드에 비해 큰 차이가 없었다. 그러나 모든 경우 수용액 상에서 단가지 펩타이드들은 다가지 펩타이드들에 비해 매우 낮은 항원성을 나타내었다. 이는 MAP 상태에서는 2F5 hmAb가 좋아하는 펩타이드 항원결정기 구조가 만들어지거나, 아니면 MAP은 한 분자내에 2개 항원 결정기를 동시에 갖고 있어 항체의 2개 항원결합부위가 MAP에 더 효율적으로 결합하여 나타나는 결과라 할 수 있다.
3. ELDKWAS 아미노산 서열중 많이 발견되는 변종을 토대로 각각 ELNKWAS, ELDEWAS, ALDKWAS, ALDKWAN 로 치환시킨 아미노산을 가지고 항원성을 분석한 결과 D 및 K 위치가 2F5 hmAb 결합에 필수적인 아미노산임을 확인하였다.
4. 2F5 hmAb의 항원결정기 서열을 포함하는 펩타이드에 대한 항체들의 항원성을 분석한 결과 P2 서열을 지닌 펩타이드에 대한 항체는 (QQE)KNEQELLE(L) (괄호안은 검증되지는 않았으나 항 P2 항체에 대한 항원결정기로 가능성 있는 부위)를 주로 인식할 것으로 여겨졌다. 이보다 더 ELDKWA 서열을 잘 인식하는 항체를 제조하기 위해 P3 서열을 지닌 펩타이드에 대한 항체를 만든 결과 내부 펩타이드 서열보다는 free Nα-amine을 포함한 N~말단을 주로 인식하는 항원성을 나타냈다. P3 보다 N-말단에 2 mer의 아미노산이 첨가된 Pl2-M2 및 P1 서열에서 유래된 P13-L의 N-말단을 운반단백질에 결합시켜 제조한 항 펩타이드 항체들은 PS 서열 (HEQELLELDKWASLWN)을 잘 인식하는 2F5 hmAb와 유사항체들이 많이 존재하였다. 위와 같은 결과는 항 펩타이드 항체 제조시 면역원으로 사용하는 펩타이드 서열 및 구조에 따라서, 제조되는 항체들이 인식하는 항원결정기가 바뀔 수 있다는 것을 제시하여 준다.
5. Western blot 상에서의 항체들의 펩타이드 및 단백질 결합을 분석한 결과, 항 펩타이드 항체는 2F5 hmAb와 같이 펩타이드뿐만 아니라 재조합 gp41 단백질 및 gp140와 강한 결합을 나타내었고 2F5 hmAb와 같이 강한 반응성을 나타내었고 이중 항 P13-L 항체는 gp41 부위에도 잘 반응하는 것으로 밝혀졌다.
6. 항 HIV-1 활성을 분석한 결과, P2 및 P3 계열에 대한 항 펩타이드 항체들은 어떤 감염 억제 효과도 관찰할 수가 없었는데, 이는 이들 항체들이 인식하는 펩타이드 항원의 구조 및 서열이 2F5 hmAb와는 차이가 있기 때문이라 여겨진다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

2F5 human monoclonal antibody (hmAb) has strong neutralizing activity against a broad range of HIV-1 primary isolates. Its epitope was reported to be ELDKWA, but production by immunization of the peptide immunogens have been found not to have the anti-HIV-1 activity. Recently, the sixteen amino acid sequence, NEQELLELDKWASLWN, was reported to be protected from the protease digestion by 2F5 hmAb.
In this study, the epitope of 2F5 hmAb was mapped by various synthetic peptides. The coating peptide antigens on the ELISA plate showed the relatively similar bindings to the 2F5 antibody, whereas the peptides in solution elicited much different antigenicity according to their sequences, sizes, number of branches and so on.
The peptides with the sequence, NEQELLELDKWASLWN, showed much higher antigenicity in solution than those with partial deletion at the sequence, whereas those differences decreased at absorbed state. This result suggest that the 16 mer sequence is required for maximum antigenicity against 2F5 hmAb. The antibody was also found to have a preference to the multiple antigenic peptides (MAP) than the linear peptides in solution. MAPs was also found to have higher coaling efficiency than the linear peptides. This results indicate that the MAP is useful for detection antibody for both soluble and absorbed peptides. In amino sequence ELDKWAS, the residues, D and K, were found to be critical for binding to 2F5 hmAb.
Since the sequence, NEQELLELDKWASLWN, is important for 2F5 neutralizing hmAb, production of anti-peptides antibodies recognizing the similar sequence with the 2F5 antibody was attempted. The anti-P2-M2 and P4-M4 antibodies were able to bind well to P1, P2, P4 peptides. However, they showed much lower affinity to P3 and P5 peptides. Among the residues of ELDKWA, only E was critical, suggesting that anti P2 antibodies may recognize the sequence, (QQE)KNEQELLE(L). To produce the antibody recognizing the 2F5 epitope, the N-terminal deleted peptides, P3-M2, P12-M2 and P5-L were designed and synthesized. The anti-P3-M2 antibodies recognized well P5-M2 with the sequence NEQELLELDKWASLWN, whereas they showed much lower binding affinities to the peptides with the N-terminal extension, indicating that the free N α -amino group at the N-terminus is important for the antibody bindings. The antibodies produced by immunization of two peptides, Pl2-M2 and P13-L, conjugated to the carrier proteins, BSA or ovalbumin, were found to produce tile antibodies recognizing the similar epitope with 2F5 antibody. These results also demonstrate that the local binding sequences of the anti-peptide antibodies can be engineered by manipulating the peptide immunogens.
The anti-peptide antibodies were found to recognize the recombinant gp41 protein and gp140. Anti-P12 and -P13 antibodies showed much stronger binding affinity to gp140 than anti-P2 antibody, suggesting that the binding affinity of an antibody to the sequence, NEQELLELDKWASLWN, is correlated well to binding to gp140. Moreover, the P13-L antibody recognized the processed gp41 like 2F5 hmAb.
Anti-P2 and -P3 antibodies elicited no anti-HIV-1 activity.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = ⅰ
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 = 8
• 1. 펩타이드 설계, 합성 및 정제 = 8
• 2. 펩타이드의 운반체 결합 = 10
• 3. 항 펩타이드 항체의 제조 = 10
• 4. 효소 면역 측정법 (ELISA) = 11
• 4-1. 항체 농도에 따른 간접 ELISA = 11
• 4-2. Coating 항원 양에 따른 간접 ELISA = 12
• 4-3. 경쟁 ELISA = 12
• 5. HIV-1 표면 단백질 발현 = 13
• 6. Western blot = 15
• 7. 항 HIV-1 활성 측정 = 15
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 17
• 1. 펩타이드 설계, 합성 및 정제 = 17
• 2. 2FS 인간단일클론항체(2F5 hmAb)의 항원성 분석 = 17
• 2-1. 다양한 길이 및 서열에 따른 항원성 분석 = 20
• 2-2. 단가지 및 다가지 항원들의 항원성 분석 = 25
• 2-3. ELDKWA중 항원성에 중요한 아미노산 잔기 분석 = 28
• 3. 항 펩타이드 항체 제조 및 항원성 분석 = 30
• 4. 항 펩타이드 항체의 펩타이드 결합 분석 = 33
• 4-1. 항원결정기 분석 = 33
• 4-2. 펩타이드의 항원성 분석 = 36
• 5. Western blot 상에서 항 펩타이드 항체들의 펩타이드 및 단백질 결합 분석. = 42
• 6. 항 HIV-1 활성 분석 = 48
• Ⅳ. 적요 = 52
• Ⅴ. 참고문헌 = 55
• ABSTRACT = 62