High Content Screening for Compounds that Induce Early Stages of Human Embryonic Stem cell Differentiation = 인간 배아 줄기세포에서의 초기 분화를 유도 하는 화합물을 찾기 위한 고속 화합물 스크리닝

국문 초록 (Abstract)

인간배아줄기세포는 자가 재생 능력과 다분화 능력을 지니고 있어 인체의 분화된 세포들을 대체 할 수 있는 가능성을 가지고 있는데, 이는 최종적으로 손상된 조직을 치료하고 할 수 있다는 면에서 그 가능성을 인정받고 있다.
이러한 줄기세포연구는 세포치료제 개발과 더불어 이를 위한 신약개발 분야 중 소분자 화합물 스크리닝 기술로 줄기세포에서의 분화 화합물을 검색하는 분야에서 그 중요성이 제기되고 있지만 널리 이용되기 위해서는 아직 해결해야할 문제점들이 남아 있다. 이러한 문제점들 중 한 가지는 줄기세포를 분화 시키는 데에 있어서의 복잡성으로, 현재 보고된 프로토콜들의 경우 대부분 줄기세포를 비슷한 동종의 세포들로 무작위 적으로 분화시키는 등 분화의 효율적인 면에서 그 문제점이 나타나고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로 세포를 좀 더 효율적으로 안전하게 분화시키기 위하여 줄기세포내의 분자적 조절기작에 영향을 미치는 화합물을 발굴하게 되는데 이와 같은 화합물검색의 필요성은 점점 더 크게 요구되고 있는 실정이다. 따라서 줄기세포의 초기 분화에 있어서 큰 영향을 미치는 새로운 분자적 화합물의 검색을 위하여, 우리는 인간배아줄기세포를 이용하여 이미지분석을 기반으로 하여 고속화합물탐색 시스템을 개발하였다.
우리연구는 줄기세포의 분화를 유도하는 화합물들 선택적으로 선택하고, 그 외에 분화효과가 없는 화합물들 또한 선택적으로 검색 해내는 이미지 기반 소프트웨어를 개발 하였다는 데에 그 의의가 있으며, 이미 상업적으로 등록되어있는 약 3520개의 화합물 라이브러리로부터 줄기세포의 분화에 영향을 미치고, retinoic acid와 비교 하였을 때에 여러 가지 형태적 특징변화를 일으키는 소분자 화합물들을 스크리닝 하였다.

핵심되는 말 : 인간 배아 줄기세포, 이미지 기반 스크리닝, 형질 분류

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Embryonic stem cells due to their self-renewal and pluripotency properties can be used to repair damaged tissues, and as an unlimited source of differentiated cells. Although stem cells represent an important opportunity for cell based therapy, and small molecules screening in the context of drug or target discovery, many drawbacks are still preventing their widespread uses. One of the most significant limitations is related to the complexity, as well as the reliability, of current protocols driving stem cells into any homogeneously differentiated cellular population. In this respect there is a strong demand for molecular agents promoting differentiation and thereby enabling robust, efficient and safe production of differentiated cells. In order to identify novel molecules that enhance early stages of differentiation, we developed an image based high content screening (HCS) approach using human embryonic stem cells (hESC). In our approach, we took advantage of custom image mining software specifically adapted for the selection of stem cell differentiation agents and the rejection of false positive hits. As a prove of concept we screened ~3500 small molecules originating from commercial libraries and were able to identify molecules of interests that show stem cell differentiation properties comparable to the phenotypic signature obtained with retinoic acid.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 3
• 1. Software development 3
• 2. hESC culture 3
• 3. hESC single cell seeding into 384 well plate 3
• 4. Compound libraries 4
• 5. High Throughput/Content Screening (HT/CS) 4
• Ⅲ. RESULTS 6
• 1. Differentiation Quantification 6
• 2. Image analysis 9
• 3. Immunofluorescence quantification 13
• 4. Z factor determination 18
• 5. Quality automated optimization 19
• 6. Early differentiation 20
• 7. Secondary screening 29
• Ⅳ. DISCUSSION 34
• Ⅴ. CONCLUSION 37
• REFERENCES 38
• ABSTRACT IN KOREAN 45