소량의 인간 간조직으로부터의 인간 간세포 분리 방법 = Human hepatocyte isolation using small

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Liver plays an important role in metabolism, detoxification, storage of nutrition and producing bile which is needed for digestion of fat. Liver cancer is the 4th common cancer. Considering the importance of this organ, the developing efficient diagnostic, therapeutic method and prevention is keenly necessary. In the stages of the development, isolation of normal and cancerous hepatocyte is inevitable. We can use them for preclinical and clinical trial. And
then, by getting various types of hepatocytes from many patients, we are able to collect data which is difficult for getting such data from cell-lines. We can isolate the hepatocytes with intact liver most effectively, but practically it is inconvenient to get complete organ. Therefore using a small portion of liver acquired from surgical operation is one possible method for isolating hepatocytes.
The basic condition of the isolation is acquired from ICR mouse experiment. Human normal hepatocyte and hepatoma cell is isolated on the condition of the ICR mouse experiment. In each step of the isolation, we identified hepatocytes with H/E staining. Isolating hepatocyte with 33% percoll which has been widely used deteriorates the separate ability. We separated the mixture
containing hepatocytes with 33%, 25%, 20% percoll respectively. The result shows that the ratio of mid-layer to bottom-layer is 0.067 in the 33% percoll, but 0.221, 0.203 in the 25%, 20% each. Thus we decided that the ideal
percentage of the percoll which has to be used is 25%. After isolated, the hepatocytes were cultured on the collagen-coated 24-well plate in DMEM for 1week. And then we identified phenotype of hepatocyte and numbers of nucli with LIVE immuno-fluorescence and DAPI staining. As a result of analyzing liver tissue of 7 people, the maximum number of the isolated normal hepatocytes is various between 1.1 x10^5/g and 4.19 x 10^6/g. It depends on the age of patient, degree of cirrhosis, the state of extracted tissue. 70% of the isolated hepatocytes remains in the mid-layer and only 30% of the rest in the bottom-layer. In the case of 6 patients, we did the same method to isolate hepatoma cells. The maximum number of the isolated normal hepatocytes is various between 7.7 x10^5/g and 5.6 x 10^6/g. If the size of the tumor is large,
the blood supply is not smooth so that many tumor cells are abrogated. And the hepatoma cells we can acquire are different depending on the degree of the cell death. Because tumor tissue is heterogeneous, the distribution of hepatoma cells we acquired is also not even. Similar to the normal hepatocyte, the hepatoma cells were also cultured on the collagen-coated 24-well plate in
DMEM for 1 week. And then we identified phenotype of hepatocyte and numbers of nuclei with LIVE immuno-fluorescence and DAPI staining. These hapatocytes and hepatoma cells which we get with novel method can
be used for many fields of research like developing specific detection material to the hepatoma such as monoclonal antibody and other therapeutic and preventive substances. To other organs we can apply this method which needs only small portion of organ for isolating cells.

국문 초록 (Abstract)

간은 인간의 신진 대사 중 중요한 부분을 담당하는 기관이며 독소 제거, 영양분 저장 및 지방을 소화시키는데 필요한 쓸개즙을 생산하는 역할을 한다. 간암은 한국인의 암 발병률 4위이며, 그러므로 이러한 중요 장기인 간에 발생하는 암을 치료, 예방, 진단할 수 있는 효과적인 방법을 개발하는 것은 매우 중요한 과제이다. 이러한 방법을 개발과정에서 중요한 요소 중 하나가 인간 간세포 및 간암 세포를 분리하는 것이다. 분리된 간세포 및 간암 세포를 사용하여 임상시험 전, 시험의 안전성을 확인 할수 있으며, 다양한 형태의 환자로부터 간세포를 획득함으로, 세포주에 대한 실험에서 확인하기 어려운 통계적인 접근이 가능하다. 가장 효율적인 간세포를 분리하는 방법은 간 전체를 사용하는 관류식 분리 방법이나 부분적인 조직이 아닌 간 전체를 사용해야 함으로, 수술시 적출되어 나오는 소량의 간조직으로부터 간세포 및 간암세포를 분리하기에는 많은 어려움이 있다. 그러므로 본 연구를 통하여 수술시 적출되어 나오는 소량의 간 조직으로부터 높은 효율로 간세포를 분리하는 방법을 개발하고자 하였다. 실험은 크게 ICR mouse를 사용하여 기본 분리 조건을 탐색하였고, 이 조건에 근거하여 인간 간세포 및 간암 세포를 분리하는 방식으로 진행하였다. ICR mouse를 사용하여 분리 실험을 진행하였고, 각 분리 과정에서 간세포가 존재한다는 것을 H/E staining으로 확인하였다. 기존에 보고되어져 있는 33% percoll로 간세포를 분리하였을 경우 분리도가 떨어지는 현상이 나타났음으로, 33%, 25%, 20% percoll로 분리하여본 결과 33% percoll에서 중층 대비 하층의 비율이 0.067로 낮게 나왔으나, 25% percoll과 20%percoll에서는 각각 0.221, 0.203으로 나타났다. 이 결과를 토대로 하여 간세포 분리 시 percoll의 농도는 25%로 결정하였다. 분리한 간세포는 collagen coated 24well plate에서 DMEM배지로 1주일간 배양하였으며 그후 정확한 간세포의 확인을 인해 LIVE immuno-fluorescence와 DAPI staining으로
세포형태와 세포내 핵 수를 확인하였다. ICR mouse에서 확인한 분리 조건을 사용하여 인간 간세포를 분리하였으며, 각 실험 단계별로 시료를 채취하여 간세포가 분리된다는 것을 확인하였다. 7명의 남성 및 여성 환자로부터 채취한 간조직을 분리하여 분석한 결과, 분리된 간세포의 수는 1g당 최대 4.19 x 10^6개에서 최소 1.1 x 10^5개로 차이가 매우 크게 나타났고, 이는
각 실험에 사용된 간조직 제공자의 나이, 간경화 정도, 채취 후 조직 처리 상태가 각기 다름으로 분리된 산세포수가 차이가 나는 것으로 판단되어진다. 그리고 간세포 분리에서 중층과 하층에 있는 간세포의 분포를 보면, 대략 분리된 간세포의 70%가 중층에 존재하며 하층에는 나머지 30%가 존재하는 것으로 관찰된다. 분리한 간세포는 collagen coated 24well plate에서 DMEM배지로 1주일간 배양하였으며 그 후 정확한 간세포의 확인을 인해 LIVE immuno-fluorescence와 DAPI staining으로 세포형태와 세포내 핵수를 확인하였다. 간암 세포 역시 같은 방법으로 분리를 하였으며, 총 6명의 간암 조직으로부터 간암세포를 분리하여본 결과 분리된 간암세포의 수는 1g당 최대 5.6 x 10^6개에서 최소 7.7x10^5개로 차이가 매우 크게 나타났다. 이는 특히 간암 조직이 큰 경우 조직 내에 혈액공급이 원활하지 않아 세포 사멸이 일어나므로 이런 조건에 따라서 분리된 간암세포의 수가 각
환자의 조직마다 달라진다고 생각된다. 세포의 분포 역시 일정하지 않았는데 이것은 암세포의 경우 heterogeneous하므로 분리 시 일정한 분포로 분리되지 않는 것으로 생각된다. 간암세포 역시 1주일간 배양 하였으며 간암세포의 확인을 인해 LIVE immuno-fluorescence와 DAPI staining으로 세포형태와 세포내 핵 수를 확인하였다.
이렇게 분리된 간세포 및 간암 세포는 감암세포에 특이적으로 작용하는 물질의 탐색•확인 또는 치료용 항체의 특이성을 확인하는데 사용이 가능하며, 임상 실험 전 안전성 확인에도 이용 될 수 있다. 그리고 간과 비슷한 형태의 조직을 가지고 있는 다른 장기의 세포 분리에 이 분리 방법을 기초로 하여 적용시킨다면 소량의 조직으로 부터도 세포를 분리 할 수 있을 것
으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• I. 서론--------------------------1
• II. 재료 및 방법------------------5
• III. 결과 및 고찰------------------9
• IV. 요약------------------------24
• V. SUMMARY------------------27
• VI. 참고문헌--------------------30