Study on the immortalization of iPSC-derived erythroid progenitor cells via tetracycline-regulated gene expression

국문 초록 (Abstract)

테트라사이클린 조절성 유전자 발현을 활용한 유도만능줄기세포 유래 적혈구 전구 세포 불멸화 연구 <지도교수 황 동 연> 차의과학대학교 대학원 생명과학과 김 유 림 수술, 항암치료, 만성 혈액질환 등에서 수혈은 필수적이나, 인구 고령화와 헌혈 기증자 감소로 인해 혈액 부족 문제가 심화되고 있다. 본 연구는 Rh- O 유도만능줄기세포를 활용하여 범용 수혈용 적혈구 생산을 위한 불멸화 적혈구 전구세포 주 개발을 목표로 하였다. 먼저, CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 AAVS1 위치에 테트라사이클린 유도성 발현 시스템과 HPV16 E6/E7 유전자를 도입하였으나, 조혈모세포에서 유전자 침묵 현상이 관찰되었다. 이를 극복하기 위해 STEMdiff™ Erythroid Kit 로 조혈모세포로 분화시킨 후, 렌티바이러스를 통해 HPV16 E6/E7을 도입하는 방식으로 전환하였다. 그 결과, 조혈모세포(CD34+CD43+)와 적혈구 계열 세포(CD71+CD235a+)의 분화 효율이 각각 71%, 80%에 달했으며, 생존율도 98%, 79%로 높게 나타났다. HPV16 E6/E7 도입 세포는 40일 간의 장기 배양에서도 안정적인 증식을 보였고, CD71+CD235a+ 세포 비율이 27%에서 42%로 증가하여 적혈구 계열 특성이 유지되었다. 특히 증식 능력이 높은 전적혈구(Pro- E)와 호염기성 적혈구(Baso-E) 단계에서 E6, E7 단백질에 의한 p53 억제와 Rb 불활성화가 세포 주기 진행을 촉진하여 증식 속도를 높이고 장기 배양을 가능케 한 것으로 보인다. 본 연구는 테트라사이클린 의존적 발현 조절이 가능한 불멸화 적혈구 전구세포주의 확립을 목표로 하여, 이를 체외 적혈구 생산 연구의 플랫폼으로 활용하고자 하였다. Rh- O 유도만능줄기세포를 활용하여 면역거부반응이 낮은 범용 수혈용 적혈구 생산 가능성을 제시하였다는 점에서 의의가 있으며, 향후 추가 연구를 통해 이를 검증할 필요가 있다.

Keyword: 불멸화 적혈구 전구세포, HPV16 E6/E7, 유도만능줄기세포, 테트라사이클린 유도성 발현 시스템

목차 (Table of Contents)

• 그림 및 표 차례
• 국문요약
• Ⅰ. 서론
• Ⅱ. 연구방법
• 1. CRISPR/Cas9 매개 HPV16 E6/E7 유전자가 도입된 유도만능줄기세포 제작
• 2. Knock-in 세포주를 이용한 조혈모세포 분화
• 3. 유세포 분석
• 4. STEMdiff™ Erythroid Kit 을 이용하여 조혈모세포 분화
• 5. 세포 형태 분석
• 6. 렌티바이러스 제작 및 조혈모세포 형질도입
• 7. 세포 증식 분석
• 8. 통계 분석
• Ⅲ. 결과
• 1. CRISPR/Cas9 매개 HPV16 E6/E7 유전자가 도입된 유도만능줄기세포주 확립
• 2. CHIR99021 농도 최적화를 통한 유도만능줄기세포의 조혈모세포 분화 및
• 유전자 발현 분석
• 3. 렌티바이러스를 이용한 불멸화 유전자 도입 및 조혈모세포 분화
• 4. 렌티바이러스로 도입된 HPV16 E6/E7의 발현 확인 및 불멸화 세포의 특성 분석
• Ⅳ. 고찰
• Ⅴ. 결론
• 참고문헌
• 영문요약