목재부후균에서 목재보존제 유효성분인 구리의 내성에 관여하는 유전자 발현에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

구리는 목재보존제의 방부 방충 효력이 우수하여 유효성분으로써 널리 사용되는 물질이지만, 자연적응에 의한 돌연변이(spontaneous mutation)는 잠재적으로 구리 향균력의 저하에 대한 가능성을 가지고 있다. 이에 어떠한 유전적 변화로 구리에 민감하게 반응하던 목재부후균이 내성을 갖게 진화하는지 알아보고자 하였다.
실험은 목재부후균의 연구모델로 적합하다고 생각되는 Saccharomyces cereuisiae W303(yeast)을 사용하여 구리에 대한 내성을 갖게 진화 시킨후 RNA를 추출하여 발현량의 변화를 관찰하였다.
S. cereuisiae W303이 생존가능한 수준의 구리농도에서부터 계대배양을 실시하여 적응을 시켜나갔고 최초에 생존이 불가능했던 농도에서도 생존이 가능하게 진화 시켰다. 이를 통해 목재부후균도 자연돌연변이를 통해 구리에 내성을 갖을 수 있다고 판단되었다.
Wild type과 mutant를 구리가 첨가되지 않은 배지와 첨가된 배지에서 배양 후 RNA를 추출하여 peak를 분석하였다. 구리가 첨가되지 않은 배지에서는 두 균 모두 일반적인 yeast의 RNA peak pattern을 보였지만 구리가 첨가된 배지쪽에서 mutant의 peak가 앞선 환경일 때와는 다른 경향을 보여 특정 유전자의 발현 패턴에 변화가 있다는 것을 확인 하였다. 그리고 이 유전자들이 내성에 관여 하고 있을 것이라고 추측하였다.
Mutant와 wild type의 구리 유무에 따른 RNA를 추출하여 microarray를 실시하였다. 유전자의 구성적 발현 변화보다 환경에 따른 RNA발현에 의해 유전자 발현의 유사성이 멀어 진다는 것을 확인 하였고, wild type에서 mutant로 진화하면서 구성적 발현에 변화를 보인 유전자들과, mutant에서 구리에의해 induction되고 repression 된다고 판단되는 유전자들도 탐색하였다.
기존 copper 내성에 관여하는 mechanism과 관련이 있을 것으로 추측되는 유전자들을 선별하였다. 선별된 8가지 유전자는 구리이온 흡수와 이동, 산화스트레스로부터 세포보호, 세포외 킬레이션 작용과 관련된 유전자들이다.
추후 진행될 연구에서는 선별된 유전자들의 증폭과 결손을 실시하여 구리환경에서 어떻게 반응을 하는지 확인하고자 한다. 최종적으로 구리내성 진화에 유의적으로 관여한다고 판단되는 유전자를 목재부후균에서 탐색할 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Copper is used as a major component of wood preservatives which have excellent biocidal effect. However, spontaneous mutation by natural adaptation has a possibility for reducing biocidal activity of copper. In this study, it was investigated that which genetic changes makes the copper sensitive wood rot fungi tolerant to copper.
The Saccharomyces cerevisiae W303, a model organism of wood rot fungi, was evolved to having copper tolerance. Then changes of RNA expression level was observed.
W303 was evolved by being exposed to copper which is used to raise its concentration from low to high. It was assumed that the wood rot fungi can have tolerance to copper by adaptation.
RNA peak pattern was analysed with total RNA extracted from wild type and mutant yeast cultured in copper-free and copper medium. Both genes showed general yeast’s RNA peak pattern in copper-free medium. However, in copper medium, mutant showed different form of RNA peak pattern than previous case. Thus. it was identified to the change in the expression pattern of some genes and suspected that they involved in tolerance of copper.
The microarray analysis was performed by using total RNA extracted from wild type and mutant harvested from copper-free and copper medium. It was observed that correlation of genes expression was reduced by induction or repression by copper than changes of constitutive expression. It was also screened to genes changed in constitutive expression and genes induced or repressed by copper.
the candidate genes which seem to involving copper resistant mechanism were screened. The 8 candidate genes was associated with mechanisms, uptake and transport of copper, protection from oxidative stress and extracellular copper chelation.
In further studies, it is being confirmed that how yeast deleted or overexpressed the candidate genes responds to copper. Finally, genes identified as involving adaptation to copper are investigating in wood rot fungi.

목차 (Table of Contents)

• List of figures Ⅳ
• List of tables Ⅵ
• 요약 Ⅶ
• I. 서론 1
• II. 연구사 3
• 1. 구리의 독성 기작 3
• 1.1. 구리의 산화환원 반응력에 의한 활성산소 생성 3
• 1.2. 활성산소에 의한 세포막 손상 4
• 1.3. 비 특이적 결합에 의한 단백질 기능 상실 5
• 2. 기존 구리 내성균의 내성기작 6
• 2.1. 세포 외 구리 킬레이트화 작용 6
• 2.2. 세포 내 구리 킬레이트화 작용 9
• 2.3. 세포벽 흡착 반응 11
• 2.4. 구리 흡수량 감소 12
• 2.5. 항산화 물질 분비 14
• III. 재료 및 방법 15
• 1. 공시 재료 15
• 1.1. 공시 균주 15
• 1.2. 공시 구리 시약 15
• 2. 실험 방법 15
• 2.1. 모델균주 S. cerevisiae W303의 생육 특성 분석 15
• 2.2. S. cerevisiae W303의 생육이 저해 받는 구리농도 분석 16
• 2.3. 구리 내성 S. cerevisiae 제작 18
• 2.4. 구리 내성 S. cerevisiae의 생육 특성 20
• 2.5. 생장 조건별 total RNA 추출 21
• 2.5.1. 생장 조건별 배양 방법 21
• 2.5.2. total RNA 추출 방법 23
• 2.5.3. total RNA 품질 평가 23
• 2.6. 구리 내성 관련 유전자 분석 24
• 2.6.1. Microarray 분석 24
• 2.6.2. 구리 내성 추측 유전자 선별 25
• IV. 결과 및 고찰 26
• 1. S. cerevisiae W303의 생육 특성 26
• 2. S. cerevisiae W303이 반응하는 구리농도 27
• 3. 구리 내성 S. cerevisiae의 특성 29
• 3.1. 구리 내성 S. cerevisiae 제작 결과 29
• 3.2. 구리 내성 S. cerevisiae의 생육 특성 31
• 3.3. S. cerevisiae W303과 구리내성 S. cerevisiae의 생육특성 비교 33
• 4. 생장 조건별 total RNA추출 결과 및 특성 35
• 5. 구리 내성 관련 유전자 분석 38
• 5.1. Microarray 결과 분석 38
• 5.1.1. 조건별 signal 의 boxplot 분석을 통한 비교 유의성 확인 결과 38
• 5.1.2. 조건별 유전자 발현 signal간 반복성 및 유사도 분석결과 39
• 5.1.3. Hierarchical clustering에 의한 조건별 유사도 분석결과 42
• 5.1.4. Hierarchical clustering heatmap을 통한 조건별 유사도 분석결과 43
• 5.1.5. MDS plot(multidimensional scaling plot)을 통한 조건별 유사도 분석결과 45
• 5.2. 유전자선별 결과 47
• 5.2.1. Barplot-Significant probes 47
• 5.2.2. 구리 내성 추측 유전자 선별 결과 49
• V. 결론 53
• VI. 참고문헌 55
• Abstract 64