In vivo application of alginate and biotin-exendin-4 complex in type2 diabetic db/db mice

국문 초록 (Abstract)

Exendin-4는 다양한 약리활성을 가지고 있고 그 중에서도 특히 제2형 당뇨병의 치료제로 많은 연구가 진행되고 있다. Exendin-4는 39개의 아미노산으로 구성되었으며 Glucagon-like peptide-1(GLP-1)과 53%의 구조를 공유하고 있다. GLP-1이 정맥투여 후에 dipeptidyl peptidase-Ⅳ(DPP-Ⅳ)에 의해 분해되기 때문에 매우 짧은 반감기를 가진데 반하여 exendin-4는 DPP-Ⅳ에 저항성을 가진 것이 특징이며, 또한 exendin-4는 β-cell을 증식시키고 혈중 글루코스 농도에 의존적으로 인슐린을 분비시킨다는 장점을 가지고 있다.
하지만 exendin-4의 기존 제형들은 경구로 투여하였을 때 pH조건이나 효소와 같은 생체 내 환경에 의해 쉽게 분해되기 때문에 정맥주사에 의한 투여방법에 의존하여 왔고, 이러한 방법은 환자의 순응도를 크게 낮추기 때문에 새로운 제형연구를 통한 경구투여방법을 모색하기 위해 alginate encapsulation과 biotinylation을 도입하였다.
Native exendin-4, biotinylated exendin-4, 그리고 alginate encapsulated biotin-exendin-4를 각각 준비하여 in vitro상에서의 안정성, 세포투과도, 약물방출 테스트를 시행하였고 in vivo상에서의 혈당강하 효과를 당뇨유발 db/db mice에서 관찰하였다. 그 결과 alginate microsphere가 약물의 안정성을 상당히 개선시켰음을 알 수 있었고, 또한 biotin의 능동수송효과로 인해 세포 투과도가 증가하였으며, 당뇨유발 mice에서의 혈당강하 효과도 가지고 있음을 관찰할 수 있었다.
이를 통해 본 연구에서는 biotin이 접합된 exendin-4의 alginate microsphere가 제2형 당뇨병 치료의 경구투여에 있어서 좋은 후보물질이라는 결론을 내릴 수 있었다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 7
• 1. MALDI-TOF mass spectrometry 7
• 2. GLP-1 8
• 3. Exendin-4 12
• 4. SMVT(Sodium dependent multivitamin transport) 16
• 5. Alginate microsphere 20
• 6. Objective 27
• II. Materials 28
• 1. Chemicals 28
• 2. Instruments 29
• III. Methods 30
• 1. Preparation and purification of biotin N-hydroxysuccinimide Ester-conjugated Exendin-4 30
• 2. Separation and purification of bioconjugated Exendin-4 ; Lys12-mono-biotin-Exendin-4, Lys27-mono-biotin-Exendin-4 and Lys12,27-di-biotin-Exendin-4 30
• 3. Characterization of Exendin-4 and biotinylated Exendin-4 species 31
• 3.1 MALDI-TOF mass spectrometry of Exendin-4 and biotinylated Exendin-4 species 31
• 3.2 Endoproteinase Lys-C digestion 31
• 4. Preparation of alginate microspheres 32
• 5. Determine of encapsulation efficiency 32
• 6. Characterization of alginate microspheres 33
• 7. The stability of biotinylated Exendin-4 encapsulated alginate microspheres in gastric homogenates 33
• 7.1 Preparation of rat gastric homogenate 33
• 7.2 The stability in rat gastric homogenate 33
• 7.3 HPLC analysis condition of Exendin-4 and biotinylated Exendin-4 in rat gastric homogenate 34
• 8. In vitro Release test of biotinylated Exendin-4 encapsulated alginate microspheres in various pH 34
• 9. Permeability of biotinylated Exendin-4 encapsulated alginate 35
• 9.1 Preparation of Caco-2 cell monolayers 35
• 9.2 Permeation study using Caco-2 cell monolayers 35
• 10. Biological activity of Exendin-4 and alginate encapsulated biotin-exendin-4 species in vivo 36
• 10.1 db/db mice 36
• 10.2 Intraperitoneal Glucose Tolerance Test (IPGTT) 36
• IV. Results and Discussion 37
• 1. Preparation, separation, purification and characterization of biotin conjugated Exendin-4 37
• 2. Preparation and characterization of biotinylated Exendin-4 loaded alginate microspheres 43
• 3. The stability of biotinylated Exendin-4 loaded alginate microspheres 46
• 4. In vitro release test of biotinylated Exendin-4 encapsulated alginate microspheres in various pH 48
• 5. Permeability of biotinylated Exendin-4 encapsulated alginate 50
• 5.1 Identification of transported native Exendin-4 and biotinylated Exendin-4 50
• 5.2 Quantitation of transported Exendin-4 and Biotinylated Exendin-4 50
• 6. Biological activity of Alginate encapsulated Biotin-Exendin-4 species in vivo 52
• V. Conclusion 54
• Reference 55
• Abstract 63
• 국문요약 65