생쥐 간세포에서 siRNA를 이용한 두가지 다른방법에 의한 EGFP유전자의 사일런스 패턴의 비교 = Comparison of gene silencing pattern of EGFP gene in mouse liver cell by two different methods using siRNA

국문 초록 (Abstract)

한글초록:RNAi는 transcription 이후 특정 sequence에서 작용하는 유전자 silencing으로 유전자 기능을 조사하기 위해 사용할 수 있는 powerful genetic tool이다. 또한, 다른 gene targeting 방법보다 값싸고, 간편한 방법이다. 본 실험은 특정 유전자를 silencing 시킨 형질전환동물을 생산하기 위한 기본적인 방법을 확립하기 위해 수행되었다. 생쥐 간 세포에서 construct transfection과 virus infection의 두가지 다른 방법으로 생쥐 U6 promotor를 연결시킨 retroviral vector pQCXIN과 pLXIZ를 통하여 siRNA expression을 시킨 후, EGFP 유전자의 silencing 양상을 비교하였고, EGFP 유전자의 발현을 다양한 시간별로 조사하였다. 지속적이고 안정적으로 EGFP를 발현하는 세포주를 생산하기 위해 생쥐 간 세포에 pEGFP-C1 constuct를 도입하였다. 이들 EGFP 발현 세포들에 EGFP siRNA를 발현시키는 retrovirus와 plasmid vector를 도입하였고, EGFP의 발현 정도를 정확히 측정하기 위해 도입 후, 24 시간 동안 3 시간 별로 RT-PCR을 수행하였다. 도입 효율을 비교하면, virus가 plasmid 보다 효율이 더 좋았다. Virus를 infection 시킨 세포에서의 EGFP 발현 정도는 infection 후, 9 시간째부터 유의적으로 감소하였고, vector를 transfection 시킨 세포에서는 transfection 후, 12 시간째부터 유의적으로 감소하였다 (P<0.05). 그러나 두가지의 다른 retroviral vector인 pRNAi와 pLXIZU6에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 본 실험은 vector와 virus간의 EGFP gene silencing 정도를 비교하기 위한, 그리고 gene silencing이 일어나기 시작하는 시간을 조사하기 위한 첫번째 실험이었다. 본 실험의 결과들은 유전자의 silencing 효과에서 retrovirus를 infection 하는 방법은 vector constuct를 transfection 하는 방법보다 더 효과적이고, 유용하다는 점을 제시하였다

국문 초록 (Abstract)

영문초록:RNAi is a process of sequence-specific posttranscriptional gene silencing and is a powerful genetic tool to analyze gene function. In addition, this technique is more inexpensive and simple than other gene targeting methods. This experiment was performed to establish the fundamental protocol to produce the specific gene silenced clone animal. To compare with gene silencing pattern of EGFP in mouse liver cell by two different methods using siRNA, retroviral vectors, pQCXIN and pLXIZ, with mouse U6 promotor were utilized as a construct and a virus. And the level of EGFP expression was investigated at various time after transfectd with constructs and infected with viruses. To produce the cell line continuously expressing EGFP, mouse liver cells were transfected with the pEGFP-C1 construct. These EGFP expressing cells were transfected with the plasmid vector and in vitro packaged retrovirus expressing EGFP siRNA. To measure the level of EGFP expression, RT-PCR was performed in every 3 hours for 24 hours from the time of transfection. When the transfection efficiency was compared between the plasmid vector and the virus, the virus infected cells was higher efficiency of transfection than the plasmid transfected cells. The level of EGFP expression from the virus infected cells was significantly decreased in 9 hours after infection, the level of EGFP expression from the vector transfected cells was significantly decreased and in 12 hours after transfection (P<0.05). However, the levels of EGFP expression between the two different retroviral vectors pRNAi and pLXIZU6 were not significantly different. This study was first experiment to compare the level of EGFP gene silencing between vector and virus, and to detect the start time of gene silencing. Therefore, results from present study suggest that the infection with in vitro packaged retrovirus is more efficient and convenient than the transfection with the retroviral construct in gene silencing effect