토끼 후외측 척추 유합술 모델에서 HM3.B10 불사화 인간 중간엽 줄기 세포를 이용한 골형성 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered as ideal cells for tissue engineering purposes. However, with respect to the limited potential for the clinical application of primary MSCs, sustainable human MSC clones might be good cellular sources for tissue engineering approach to bone regeneration. The present study was designed to investigate the survival and osteogenic effect of HM3.B10 (B10) immortalized human mesenchymal stem cells in a rabbit posterolateral fusion model.
B10 cell line, one of clonal immortalized human mesenchymal stem cell lines transfected with a retroviral vector encoding v-myc oncogene, was used in this study. B10 cells were cultured in osteogenic differentiation medium and the osteogenic capability was assessed using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis. Osteogenically differentiated B10 cells were loaded onto porous hydroxyapatite (HA) granules and attachment of the cells was confirmed using a photomicroscopy and scanning electron microscopy (SEM). The B10 cells were labeled with fluorescent magnetic nanoparticles for tracing. Posterolateral spinal fusion was performed in eight mature New Zealand white rabbits. One of the rabbits was allocated to undergo posterolateral fusion surgery without placing grafts as a non-implanted control. After a dorsal midline skin incision, the intermuscular plane between the multifidus and longissimus muscle was developed to expose the transverse processes of L4 and L5 as well as the intertransverse membrane. Either right or left side was randomly allocated to receive HA granules with B10 cells (experimental side) or HA granules only (control side). At 6 weeks after surgery, the survival of MSCs was evaluated using magnetic resonance image (MRI) and fluorescent image analysis. In addition, new bone formation was analyzed using radiographs, microcomputed tomography (µ-CT), and histologic evaluation.
B10 cells cultured in osteogenic differentiation medium demonstrated a high level of osteogenic gene expression, including Runx2 and bone sialoprotein. The survival of the MSCs labeled with fluorescent magnetic nanoparticles was confirmed: the low signal dimensions in the graft mass on T2-weighted images of MRI were demonstrated and the remained labeled MSCs were observed on confocal laser microscopic imaging at the same area of the low signal dimensions on T2-weighted images. On the µ-CT evaluation, relative bone volumes (BV) of new bone to HA scaffold in the experimenatal side and the control side were 0.41 ± 0.02 and 0.37 ± 0.01, respectively (p=0.043). Relative bone surface area (BS) of new bone to HA scaffold in the experimental side and the control side were 0.27 ± 0.02 and 0.23 ± 0.02, respectively (p=0.043). Relative bone mineral density (BMD) of total graft mass to HA scaffold in the experimental side and the control side were 3.26 ± 0.45 and 2.63 ± 0.31, respectively (p=0.043). All three indices of µ-CT indicated significantly more new bone formation in the experimental side compared with that of the control side. The accurate assessment of spinal fusion was difficult both on radiographs and µ-CT because of the remnant radio-opaque HA granules. On the histologic evaluation, the experimental sides demonstrated more abundant cartilage and immature woven bones in the grafted masses compared with the control sides demonstrating poorly organized fibrous tissue without bone formation.
B10 immortalized human mesenchymal stem cells can survive and participated in enhancement of osteogenesis in a rabbit spinal fusion model. Therefore, this cell line might be a potential alternative to autogenous MSCs for cell therapy.

국문 초록 (Abstract)

본연구에서는 v-myc 종양유전자의 전사로 유도된 불사화된 인간 중간엽 줄기 세포를 hydroxyapatite (HA) granules 과 함께 토끼 후외측 척추 유합술 모델에 적용하였을 때 초기 골형성 시기에서 불사화 인간 중간엽 줄기 세포의 생존과 신생골 형성의 촉진 효과를 확인해 보고자 하였다.
불사화 인간 중간엽 줄기세포를 단층배양 후 골형성능 평가를 위해 골분화 관련 유전자의 발현을 reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석을 이용하여 대조군과 비교 평가하였다. 토끼 한마리의 일측 유합술을 위해 불사화 인간 중간엽 줄기세포 106 개를 주의하여 HA granules 에 부착시키고 1주 더 골유도 배양액에서 배양 후 수술일에 이식하였다. 이식 전 중간엽 줄기세포의 HA에의 부착 및 분화 여부를 평가하고자 scanning electron microscopy (SEM) 을 시행하였다. 이식시 ‘실험측’에는 중간엽 줄기 세포가 부착된 HA를 이식하고, 나머지 반대측은 ‘대조측’으로 하여 세포 부착 없이 HA만 이식하였다. 중간엽 줄기세포의 토끼 척추에서의 세포 추적을 위해 자기 공명 영상 (MRI) 과 confocal laser microscopy 를 이용하여 이중 경로로 탐지가 가능한 fluorescent magnetic nanoparticles를 세포 표지자로 부착시켰다. 이식 후 6주 째 골형성 정도 및 척추 유합을 평가하기 위하여 단순 방사선학적 검사, 미세 컴퓨터 단층 촬영 (µ-CT) 및 조직학적 검사를 시행하였다.
골분화 유전자 발현에 대한 평가를 위해 RT-PCR을 시행한 결과 Runx2 와 bone sialoprotein 모두 높은 수준의 발현이 실험측에서 관찰되었다. 중간엽 줄기 세포가 HA에 잘 부착되어있으며 골분화가 진행된 소견이 SEM 으로 확인되었다. MRI 상에서 저신호 강도를 보이는 fluorescent magnetic particles 로 표시된 중간엽 줄기세포가 1주 와 6주 모두 같은 영역에서 탐지되었으며, 이 부위에서 형광 신호를 보이는 중간엽 줄기세포를 confocal microscope 로도 확인할 수 있었다. 단순 방사선 검사와 µ-CT 에서 정확한 척추 유합의 평가는 HA의 radioopacity 로 인하여 통계적 분석은 시행할 수 없었다. µ-CT 상에서 측정된 신생골의 골 용적과 골 표면적은 HA 값에 대한 상대 값으로 계산되었으며, 골밀도는 HA 값에 대한 전체 골밀도의 상대값으로 측정하였다. 상대적 신생골 용적은 실험측과 대조측에서 각각 0.41 ± 0.02 과 0.37 ± 0.01 였으며 이는 통계적으로 유의하였다 (p=0.043). 상대적 신생골 표면적은 실험측과 대조측에서 각각 0.27 ± 0.02 과 0.23 ± 0.02 였으며 이는 통계적으로 유의하였다 (p=0.043). 상대적 골밀도는 실험측과 대조측에서 각각 3.26 ± 0.45 과 2.63 ± 0.31 였으며 이는 통계적으로 유의하였다 (p=0.043). 조직학적 검사에서 양측 모두에서 다량의 골형성 소견은 관찰되지 않았으나, 실험측에서 연골과 연골내 골화, 미성숙 골이 흔히 발견되는 반면에 대조측에서는 섬유화 외에 연골내 골화나 미성숙 골은 모든 시편에서 발견되지 않았다.
불사화 인간 중간엽 줄기세포는 토끼 척추 유합술 모델에서 생존하면서 골유합에 기여 하여 신생골 형성을 촉진 시키는 효과가 있는 것으로 판단되며, 세포 치료의 중요한 원천으로서 자가 중간엽 줄기세포에 대한 대체 세포주로서의 사용 가능성이 있을 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• II. Materials and methods 3
• III. Results 10
• IV. Discussion 13
• V. Conclusion 17
• VI. References 18
• VII. Appendix 24
• VIII. 국문초록 41
• IX. Abstract 44