NMR을 이용한 CD44의 세포 내 영역과 유사 생체막 사이의 결합에 관한 구조 연구

국문 초록 (Abstract)

CD44는 단일 통과 막단백질로, 세포-세포, 세포-기질의 결합 및 부착 이동의 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. CD44는 4가지 영역으로 나뉘며, 세포 외 영역, 줄기영역, 막 내부 영역, 세포 내 영역으로 구성됩니다. 막 내부 영역과 세포 내 영역 모두 구조연구를 진행하였고, γ-secretase에 의하여 잘린 산물들의 원자레벨수준에서의 연구가 보고된바가 없습니다. CD44의 세포 내 영역과 다른 결합단백질들과의 결합에 관한 연구가 없습니다. CD44의 조절 메커니즘은 유방암의 전이의 중요한 역할을 하는데, CD44의 세포 내 영역의 다양한 단백질들과의 결합으로 조절되는 것으로 알려져 있습니다. 다양한 단백질들의 결합 부위가 막 내부 영역 근처의 존재하기 때문에, 막과의 연관성이 존재할 수 있습니다. 이러한 연관성은 CD44의 구조와 기능의 영향을 줄 수 있다. 본 연구에서는 CD44 의 ICD와 construct1의 막과의 연관성을 NMR을 통하여 구조연구를 진행하였습니다. 우리는 CD44 ICD와 construct1을 detergent micelle인 LMPG 환경 속에서 2D 1H-15N HSQC 실험을 진행하였으며 CSP를 통하여 비교하였습니다. CSP로 ICD의 N-terminal 과 막과의 연관성을 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

CD44 is a single-spanning membrane protein that plays important roles in cell-cell and cell-matrix interactions, adhesion and migration. CD44 consists of four regions: the extracellular domain (ECD), the stem region, the transmembrane domain (TMD) , and the intracellular domain (ICD). Structural studies of both TMD and ICD region, which are products of cleavage by the γ-secretase have not been reported with an atomic resolution. The structures of CD44 ICD and its complex with other binding partners were not reported. The CD44 regulatory mechanism plays an important role in the metastasis of cancer cells, and it is particularly related to breast cancer metastasis. It has been reported that it is regulated by the binding of the C-terminal region of CD44 with various proteins. Since the binding site of various proteins exist near the transmembrane region, there might be association with the membrane. These associations will affect the structure and function of CD44. In the present study, structural studies on the membrane association of CD44 ICD and the CD44 construct1, were performed using NMR spectroscopy. We compared chemical shift perturbation (CSP) by conducting a 2D 1H-15N HSQC experiment of CD44 ICD and construct1 in the detergent LMPG. CSP confirmed that there were association between membrane environment and N-terminal region of ICD.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 2
• Ⅱ. 실험 재료 및 방법 7
• 1. 유전자 클로닝 및 발현벡터 구축 7
• 1-1. 막 영역이 포함된 CD44(construct1) 7
• 1-2. CD44 ICD 9
• 2. 대장균을 이용한 재조합 단백질 CD44의 발현 11
• 3. 재조합 단백질 CD44의 정제 12
• 3-1. CD44 construct1 12
• 3-2. CD44 ICD 14
• 4. 2D and 3D NMR 분석 16
• 4-1. CD44 construct1 16
• 4-2. CD44 ICD 18
• 5. CD44 construct1 C667F, C676F 유전자 클로닝 19
• 6. Nanodisc (MSP1E1) 발현 및 정제 21
• Ⅲ. 실험 결과 및 고찰 23
• 1. CD44 발현벡터 제작 23
• 1-1. CD44 Construct1 23
• 1-2. CD44 ICD 23
• 2. 재조합 단백질 CD44의 발현 및 정제 25
• 3. CD44 ICD의 with/without membrane의 HSQC 및 CSP 비교 27
• 4. CD44 construct1과 CD44 ICD의 HSQC 및 CSP, CSI 비교 30
• 5. CD44 construct1 C667F 및 C676F의 HSQC 및 CSP 비교 35
• 6. CD44 construct1의 detergent micelle과 nanodisc의 HSQC 비교 40
• Ⅳ. 결 론 43
• 참고문헌 또는 인용문헌 44
• 한글 초록 47
• 감사의 글 48