나이트로소아민 유도체의 합성과 산화질소의 생성 및 세포독성

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Nitric oxide is a kind of signaling molecule and is involved in various physiological activities such as immune function, vasodilation and signal transduction. Since nitric oxide is a very unstable substance, it is difficult to control the time to deliver it to a desired target. A nitric oxide precursor can be used as a carrier that can control it. Currently, various nitric oxide precursors such as S-nitrosothiols, N-nitrosamines, N-diazeniumdiolates, and metal nitrosyls have been reported, and these nitric oxide precursors are widely known as medicines and therapeutic agents for disease treatment.
In this study, a nitrosoamine derivative of N-N bond with an intermediate bond dissociation energy among nitroso compounds was synthesized. N-nitrosamine [NMA, NEA, NAA, NDPA, NDBA] was synthesized using tert-butyl nitrite and secondary amine having alkyl and aryl substituents. N-nitrosamide [NBA, NMBA] was synthesized using a secondary amine having an amide substituent and tert-butyl nitrite. Basic amino acids were also reacted with tert-butyl nitrite to synthesize N-nitrosated amino acids [NLA, NLL, NLH]. The synthesis of the target compound was confirmed using 1H-NMR and GC-MS,
Nitric oxide generation assay was performed through UV-Vis absorption spectrum through azo-dye production reaction of nitric oxide produced from the synthesized nitric oxide precursor and Griess reagent. In addition, a cytotoxicity assay was performed for nitric oxide generated from nitric oxide precursors through two cytotoxicity tests.
When an aromatic compound is present in the alkyl group next to the secondary amine [NMA, NEA, NAA, NDPA], the synthesis time was short and synthesis was possible even at room temperature. In the case of the NBA, it was not synthesized. It was inferred that the benzene next to the carbonyl group takes electrons and the amine lacks electrons, so the amine protons do not fall off easily, so synthesis is not possible.
In the UV-Vis absorption spectrum through the azo-dye generation reaction using Griess reagent, the time taken to the maximum emission of nitric oxide generated from the nitric oxide precursor was similar at about 90 minutes. However, there was a difference in the release rate up to 90 minutes before.
Through two cytotoxicity tests, a cytotoxicity assay for nitric oxide generated from nitric oxide precursors was performed. In the cell viability assay, nitric oxide precursors diluted to three concentrations (100 mM, 1 mM, 1 μM) were administered to MDA-MB-231 cells. All of the cell groups administered at a concentration of 100 mM died, and at concentrations of 1 mM and 1 μM, cell death was at least twice that of the raw material, but there was no difference as much as a 103 fold difference in concentration. In the Cell MTT assay, a nitric oxide precursor diluted to a concentration of 100 μM was used, and the group using the raw material and the group administered with nitric oxide showed an absorbance difference of about 0.05 at 60 and 90 minutes.

국문 초록 (Abstract)

산화질소는 일종의 신호전달 분자로서 면역 작용, 혈관 확장 및 신호 전달 등의 다양한 생리 활성에 관여한다. 산화질소는 매우 불안정한 물질이므로, 이를 원하는 표적으로 전달하는 시간의 조절이 어렵다. 이를 조절할 수 있는 전달체로서 산화질소 전구체가 있다. 현재까지 S-nitrosothiols, N-nitrosamines, N-diazeniumdiolates, metal nitrosyls 등의 다양한 산화질소 전구체가 보고 된 바 있고, 이러한 산화질소 전구체들은 질병 치료를 위한 의약 및 치료제로 널리 알려져 있다.
본 연구에서는 Nitroso compound에서 중간의 bond dissociation energy를 가진 N-N bond의 나이트로소아민 유도체를 합성하였다. Alkyl, aryl의 치환기가 있는 2차 아민과 tert-butyl nitrite을 이용하여 N-nitrosamine [NMA, NEA, NAA, NDPA, NDBA]을 합성하였고, amide 치환기가 있는 2차 아민과 tert-butyl nitrite을 이용하여 N-nitrosamide [NBA, NMBA]을 합성하였다. 염기성 아미노산도 tert-butyl nitrite과 반응시키어 N-nitrosated amino acid [NLA, NLL, NLH]을 합성하였다. 1H-NMR과 GC-MS를 이용하여 목표화합물의 합성을 확인하였고, 합성된 산화질소 전구체에서 생성된 산화질소와 Griess reagent의 azo-dye 생성 반응을 통한 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 통해 산화질소생성 assay를 진행하였다. 또한 두가지의 세포독성시험을 통해 산화질소 전구체에서 생성된 산화질소에 대한 세포독성 assay를 진행하였다.
2차 아민 옆의 알킬기에 방향족 화합물이 존재하는 경우 [NMA, NEA, NAA, NDPA] 합성시간이 대체로 짧고 상온에서도 합성이 가능하였다. NBA의 경우 합성이 되지 않았는데, 이는 카보닐기 옆의 benzene이 전자를 가져가서 아민의 전자 결핍이 생기기 때문에 양성자가 잘 떨어지지 않아 합성이 안되는 것으로 유추하였다.
Griess reagent를 이용한 azo-dye 생성 반응을 통한 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 보면 산화질소 전구체에서 생성된 산화질소의 최대 방출까지 걸리는 시간은 약 90분으로 비슷하였으나, 90분 전까지의 방출 속도에서의 차이가 있었다.
두가지의 세포독성시험을 통해 산화질소 전구체에서 생성된 산화질소에 대한 세포독성 assay를 진행하였다. Cell viability assay에서는 세가지 농도 (100 mM, 1 mM, 1μM)로 희석한 산화질소 전구체를 MDA-MB-231 cell에 투여하였다. 100 mM의 농도를 투여한 세포그룹은 모두 사멸하였고 1 mM, 1 μM농도에서는 원물질 대비 최소 두배 이상의 세포사멸을 보였지만, 103배의 농도 차 만큼의 차이점은 없었다. Cell MTT assay에서는 100 μM 농도로 희석한 산화질소 전구체를 사용하였고, 원물질과 산화질소를 생성한 그룹은 60분, 90분에서 약 0.05의 absorbance 차이를 보였다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• 1. 연구 배경 1
• 1.1 산화질소 1
• 1.1.1 산화질소의 활용 2
• 1.2 산화질소 전구체 3
• 1.2.1 아민과 나이트로소늄 이온의 반응 4
• 1.2.2 tert-Butyl nitrite을 이용한 나이트로소아민의 합성 7
• 1.3 Griess reagent를 통한 산화질소 생성 측정 8
• 2. 연구 목적 및 범위 9
• 2.1 연구 목적 9
• 2.2 연구 범위 10
• 2.2.1 나이트로소아민의 합성 10
• 2.2.2 나이트로소 화합물의 산화질소 생성과 세포독성 10
• Ⅱ. 본 론 13
• 1. 시약 및 기기 13
• 2. 실험방법 14
• 2.1 N-nitrosamine의 합성 14
• 2.1.1 N-nitroso-N-methylaniline 14
• 2.1.2 N-nitroso-N-ethylaniline 14
• 2.1.3 N-nitroso-N-allylaniline 15
• 2.1.4 N-nitrosodiphenylamine 16
• 2.1.5 N-nitrosodibenzylamine 16
• 2.2 N-nitrosamide의 합성 17
• 2.2.1 N-nitrosobenzanilide 17
• 2.2.2 N-nitroso-N-methylbenzamide 17
• 2.3 N-nitrosated amino acid의 합성 18
• 2.3.1 N-nitroso-L-arginine 18
• 2.3.2 N-nitroso-L-lysine 19
• 2.3.3 N-nitroso-L-histidine 19
• 2.4 Griess reagent를 이용한 UV-Vis 분석 20
• 2.5 세포독성시험 21
• 2.5.1 Cell viability assay 21
• 2.5.2 Cell MTT assay 21
• 3. 결과 및 토의 22
• 3.1 N-nitrosamine의 합성 분석 22
• 3.2 N-nitrosamide의 합성 분석 26
• 3.3 N-nitrosated amino acid의 합성 분석 28
• 3.4 Griess reagent를 이용한 UV-Vis 분석 32
• 3.5 세포독성시험 38
• 3.5.1 Cell viability assay 38
• 3.5.2 Cell MTT assay 42
• Ⅲ. 결 론 44
• 참고문헌 46
• 부 록 49