Identification of fangchinoline as a novel natural NR4A1 inactivator and its anti-cancer effect = 고아핵수용체 NR4A1 저해제 Fangchinoline의 발굴 및 항암기전에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

고아핵수용체(orphan nuclear receptor)의 하나인 NR4A1은 췌장암을 비롯한 많은 종류의 종양 조직에서 과 발현하고 있으며, 다양한 경로를 통해 암세포의 성장과 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다.
본 연구에서는 NR4A1의 저해활성을 가지는 저분자 물질을 찾기 위해 한약재 유래의 저분자 단일물질 라이브러리를 이용하여 reporter gene assay 방법으로 NBRE 영역의 전사활성을 조절하는 물질을 탐색하였다. 그 결과, fangchinoline (FCN)을 5 μg/ml의 농도로 18 시간 처리 했을 때 NR4A1 전사활성을 51.2% 저해하는 결과를 얻어 후보물질로 선택하였으며, 항암활성과 기전을 알아보고자 하였다. FCN은 NR4A1을 과발현 하고 있는 췌장암 세포주 MiaPaCa-2에서 NR4A1의 전사활성을 농도 의존적으로 저해하였으며 세포자멸사를 유도하여 췌장암세포의 성장을 억제하였다. NR4A1에 의해 매개되는 항암기전은 세포자멸사를 억제하고 있는 단백질인 Survivin 발현양의 감소를 통한 기전 (Mechanism 1)과, reactive oxygen species (ROS)를 발생시켜 ER stress를 유도하는 기전 (Mechanism 2)에 의해 유도된다고 보고하여(3,6) FCN을 처리한 뒤 그 작용 기전에 대해 알아보고자 하였다. MiaPaCa-2 인간 췌장암 세포주에 FCN을 처리하여 reporter gene과 Western blot 분석을 이용해 Mechanism 1, 2를 확인해 본 결과, FCN은 Sp1에 의해 매개되는 survivin 전사활성과 단백질 감소를 유도하는 기전(Mechanism 1)과 ROS를 발생시켜 ER stress를 유도하는 신호전달체계를 활성화시키는 기전(Mechanism 2)을 통해 NR4A1 의존적인 세포자멸사를 유도하는 것을 확인하였다.
결론적으로, NR4A1을 과발현하고 있는 췌장암 세포에서의 FCN의 처리는 발암성 전사인자로서 작용하는 NR4A1의 전사활성을 조절함으로써 암세포의 생육을 저해한다고 볼 수 있다. 이로써 본 연구의 결과들은 FCN이 발암유전자인 NR4A1을 표적하는 새로운 천연물 유래의 췌장암 치료제 혹은 보조적 치료제로 개발될 가능성을 제시하였으며, 관련 연구의 활성화와 기초자료 제공에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Previous studies have demonstrated that the orphan nuclear receptor NR4A1 is overexpressed in human pancreatic cancer and antagonizing this receptor promotes apoptosis and inhibits pancreatic cancer cells and tumor growth. In the present study, to identify new natural NR4A1 inactivators, a natural product (herbal medicine)-based small molecule library was screened using a luciferase construct containing NR4A1-binding response elements (NBRE-luc) and Gal4-NR4A1 fusion construct (Gal4-NR4A1) that activate a Gal4 reporter construct containing five tandem Gal4 response elements (Gal4-RE-luc). As a result, we identified fangchinoline (FCN), a bisbenzyltetra- hydroisoquinoline alkaloid from Stephania tetrandra, as a new inactivator of nuclear NR4A1 and demonstrated that FCN inhibited cell proliferation and induced apoptosis, in part, via the NR4A1-dependent pro-apoptotic pathways in human pancreatic cancer cells. It decreased the expression of the antiapoptotic protein survivin by inhibiting Sp1-mediated transcription and induced oxidative stress-mediated endoplasmic reticulum (ER) stress in pancreatic cancer cells. These results suggested that inhibition of NR4A1-mediated transcriptional activity was involved in the anticancer effects of FCN, and FCN represents a novel class of mechanism-based anticancer agents targeting the pro-oncogenic NR4A1 which is overexpressed in pancreatic cancer. Also, structure-activity studies of FCN analogs and ligand-receptor interaction studies are ongoing to identify the more effective and specific NR4A1 inactivators for future clinical applications of cancer chemotherapy.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and Methods 5
• 2.1. Cell culture and plasmids 5
• 2.2. Cell viability assay 5
• 2.3. Transfection and reporter gene assay 6
• 2.4. Determination of ROS production 6
• 2.5. Determination of intracellular ROS 7
• 2.6. Subcellular localization assay 7
• 2.7. Western blot analysis 8
• 2.8. Real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis 8
• 2.9. Statistical analysis 11
• Ⅲ. Results and Discussion 12
• 3.1. FCN inhibits nuclear NR4A1 transactivation 12
• 3.2. FCN inhibits nuclear NR4A1 transactivation through its NH2 terminal region 17
• 3.3. FCN inhibits cell proliferation and induces apoptosis in pancreatic cancer cells 20
• 3.4. FCN decrease Survivin expression through inhibition of Sp1-dependent transactivation 27
• 3.5. FCN induces ROS and ER stress in pancreatic cancer cells 30
• 3.6. Comparable effects of FCN and its structural analog tetrandrine 33
• 3.7. Anti-cancer effect Stephania tetrandra S. Moore extract and its underlying mechanisms 35
• Ⅳ. Conclusion 37
• Ⅴ. References 38
• Abstract 43
• 국문초록 45