정장제용 Lactobacillus spp.의 Clostridium butyricum의 생장 증진과 중금속 제거 및 내산성에 관한 특성 연구

국문 초록 (Abstract)

건강에 도움을 줄 수 있는 것으로 알려진 프로바이오틱스에 대한 연구들은 다양한 방면에서 지속적으로 연구되고 있으며, 소비자들의 건강에 대한 관심도의 증가는 프로바이오틱스 시장을 지속적으로 성장시키고 있다. 또한 최근 연구들을 통하여 장내 미생물 구성 및 미생물의 대사산물은 위장뿐 아니라 면역체계, 대사질환 및 정상적인 중추신경계 기능까지 전방위적으로 영향을 미친다는 것이 증명되고 있다. 이러한 연구 결과 및 시장의 확대로 잠재적 프로바이오틱스의 다양한 기능성에 관한 연구들이 요구되고 있다. 본 연구에서는 프로바이오틱스로써 가장 많이 사용되는 균 중 하나인 Lactobacillus 속 유산균들의 프로바이오틱스로서 다양한 기능성 연구를 수행하였으며, 보유하고 있는 건강한 한국 여성으로부터 분리한 83 균주의 유산균과 2008년부터 패류에서 분리해온 166 균주의 유산균을 대상으로 잠재적 프로바이오틱스인 Lactobacillus의 탐색 및 특성 연구를 수행하였다.
먼저 유산균에 의한 Clostridium butyricum의 생장 증진 효과에 대한 연구를 수행하였다. C. butyricum은 건강한 사람과 동물의 장 내에서 자주 발견되는 균으로 butyric acid를 생산하고, 장 내 형태를 개선하는 등 이로운 효과를 가지고 있으며, 일부 균주는 프로바이오틱스로서 안정성이 확인되었다. 본 연구에서는 생균수 확인과 qPCR을 이용하여 Lactobacillus parabuchneri MH44와 Lactobacillus brevis JL16에 의한 C. butyricum 생장 증진 효과를 확인하였으며, butyric acid를 생산에 관여하는 주요 유전자인 buk gene의 발현량 증가를 확인하였다. 두 Lactobacillus의 프로바이오틱스로서의 기본 특성을 확인하기 위하여 산과 담즙 내성, auto-aggregation, 동결건조 스트레스 내성 및 가속화 실험을 수행하였으며, 두 균주 모두 산에 대한 내성이 낮아 이에 대한 보완이 필요함을 확인하였다. 이후 유산균 전용 상업용 배지에서 L. parabuchneri MH44의 배양 (4 L)을 통해 상업화 가능성을 확인하였다.
두 번째로, 유산균의 산 내성과 관련된 연구를 수행하였다. 섭취 후 살아서 장까지 도달하여야 하는 프로바이오틱스는 기본적으로 위장 내에서 노출되는 스트레스, 특히 위의 극도로 낮은 pH에 대한 내성이 있어야 한다. 본 연구에서 발굴한 Lactobacillus johnsonii MH33, L. johnsonii MH21과 Lactobacillus gasseri KLB240은 프로바이오틱스에 있어 가장 큰 스트레스 요인인 산 저항성이 우수한 균주로 pH 2에서 3시간까지 초기 농도의 0.1%의 생존율을 확인하였다. SEM 분석을 통하여 산성 조건에서 세포 형태변화를 확인하였으며, L. gasseri KLB240만 pH 2에서 6시간 후 세포 표면의 손상을 확인하였다. 또한 산 저항성과 연관 있다고 알려진 atpD gene의 발현이 중성 조건 (pH 7.2)에서보다 산성 조건 (pH 2)에서 증가함을 RT-qPCR을 통하여 분석하였다. 더불어, 산 저항성을 높이는 대사경로에 필요한 기질인 arginine과 glutamate를 첨가하였을 때, L. gasseri KLB240의 산 저항성 (pH 2)이 증진되는 것을 확인하였다. 세 Lactobacillus의 프로바이오틱스로서 기본 특성을 확인하기 위하여 담즙 내성, auto-aggregation, 동결건조 스트레스 내성을 확인하였고, 가속화 실험을 통하여 L. johnsonii MH33과 L. gasseri KLB240가 각각 250일 이상 냉장 보관 가능할 것으로 예측하였다. 이 두 유산균 L. johnsonii MH33과 L. gasseri KLB240를 유산균 전용 상업용 배지에서 배양 (4 L)을 진행하였으나, L. gasseri KLB240만이 109 CFU/mL 규모로 배양되었다.
마지막으로, 유산균를 통한 중금속 제거 및 내성과 관련된 연구를 수행하였다. 중금속은 인체에 누적 시 배출이 어려워 적은 양에 대한 노출에도 잠재적인 위험성을 가지고 있다. 인체에 유해하다고 알려진 대표적인 중금속인 Pb, Cd, As, Cu에 대해 내성이 있는 유산균 7 균주의 중금속 제거능을 ICP-OES를 통하여 확인하였으며, 상대적으로 제거율이 낮았던 Cd, As에 대하여 균주의 농도를 높인 결과 균주 간의 제거율은 큰 차이가 없음을 확인하였다. 프로바이오틱스로서 유산균의 안전성에 문제가 될 수 있는 항생제 내성은 중금속 내성과 유전적 연관성이 있다고 알려져 있어 7 유산균의 항생제 내성을 확인하고 항생제 다재내성 지수가 0.32 이하로 확인된 3 균주 (L. fermentum KLB79, KLB100, KLB203)를 최종 선택하였다. 각 Lactobacillus가 갖는 프로바이오틱스로서 기본 특성 (산과 담즙 내성, Auto-aggregation, 동결건조 스트레스 내성)을 확인하였으며, L. fermentum KLB203이 가장 높은 결과를 나타냈으며, 이후 가속화 실험에서도 냉장보관 시 가장 긴 기간인 140일 정도 보관이 가능할 것으로 예측되었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Probiotics has previously demonstrated the health promotion effects associated with the gastrointestinal tract, and the growing interest in health among consumers continues to grow the size of the probiotics market. Recent findings on microbes in the field have made it possible to expect more diverse effects from gut microbiota, and the expansion of the probiotics market is demanding studies of various functionalities for potential probiotics. We have continuously collected 83 Lactobacillus strains from healthy Korean women and 166 Lactobacillus strains from shellfish since 2008. The aim of this study was to examine the growth promotion effect of Clostridium butyricum, acid resistance and heavy metal removal effect as a potential probiotics of Lactobacillus.
The intestinal microorganisms and their microbial metabolites are proving to affect almost every aspect of human health, not only the intestinal health but also immune system, metabolic diseases and normal central nervous system functions. C. butyricum is a bacterium often found in the intestines of healthy people and animals and has beneficial effects, such as producing butyric acid, improving intestinal form, and some strains have been confirmed to be safe as probiotics. The effects of improving C. butyricum growth of Lactobacillus parabuchneri MH44 and Lactobacillus brevis JL16 were confirmed by determining the cell number. Using qPCR the expression of buk gene, which is involved in the production of butyric acid was found to be enhanced by Lactobacillus. The characterization (acid and bile resistance, auto-aggregation, freeze-drying stress tolerance) of L. parabuchneri MH44 and L. brevis JL16 for essential probiotics confirmed that before being used as probiotics, acid resistance of each strain must be supplemented. The possibility of commercialization was examined accelerated storage experiment and fermentation (4L) of L. parabuchneri MH44.
Probiotics that are supposed to reach the intestine should basically be resistant to stresses exposed during tranfer, especially extreme low pH. We found three strains, Lactobacillus johnsonii MH33, L. johnsonii MH21 and Lactobacillus gasseri KLB240 are highly acid resistant strains, with survival rates of more than 0.1% at initial concentrations from pH 2 to 3 hours. The SEM analysis identified cell shape changes in acid conditions and the expression of atpD gene known to be associated with acid resistance, increased in acidic condition (pH 2) than in neutral conditions (pH 7.2). Further, it was confirmed that acid resistance (pH 2) of L. gasseri KLB240 increased with arginine and glutamate, which are the necessary substrates for metabolic pathways that enhance acid resistance. To determine the essential properties of the two Lactobacillus as probiotics, acid and bile resistance, auto-aggregation, freeze-drying stress tolerance were examined. In the acceleration experiment after freeze-drying using skimmed milk, L. johnsonii MH33 and L. gasseri KLB240 were expected to be stored up to 8 months at 4℃, respectively. In the media for commercial probiotics production, L. gasseri KLB240 reached the stationary phase at above 109 CFU/mL after 9 hours, but L. johnsonii MH33 was not cultured with possible reasons such as inadequate culture conditions and media.
Heavy metals are difficult to eliminate when accumulated in the human body, imposing health hazard even if exposed to small amounts. The removal capability of 7 lactic acid bacteria was confirmed through ICP-OES for Pb, Cd, As, and Cu, which are representative heavy metals harmful to the human body, and the tendency to increase the removal rate by increasing the concentration of strains for Cd and As, which had relatively low removal rates, was confirmed. Antibiotic resistance which could be a problem with the safety of probiotics is known to be genetically related to heavy metal resistance, therefore the antibiotic resistance of 7 Lactobacillus strains was examined and the final choice of 3 strains (L. fermentum KLB79, KLB100, KLB203) with less than 0.31 multidrug resistance index was made. To determine the essential properties of the three Lactobacillus as probiotics, KLB203 strain showed more desirable characteristics such as resistance to bile and auto-aggregation.In the acceleration experiment after freeze-drying using skimmed milk, L. fermentum KLB79, KLB100 and KLB203 were expected to be stored up to 22, 54 and 140 months at 4℃, respectively.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• 1. 프로바이오틱스(Probiotics) 1
• 2. Clostridium butyricum 5
• 3. 산 스트레스와 프로바이오틱스 7
• 4. 중금속 제거 8
• 4.1 중금속 8
• 4.2 미생물의 중금속 제거 및 내성 10
• 5. 연구 목적 12
• Ⅱ. 재료 및 방법 13
• 1. Lactic acid bacteria strains 13
• 2. Stimulation of C. butyricum growth by Lactobacillus spp. 15
• 2.1 Stimulation of C. butyricum growth by Lactic acid bacteria 15
• 2.2 Quantification of buk gene expression 16
• 3. Resistance of Lactobacillus in acidic conditions 18
• 3.1 Screening for acid resistant lactic acid bacteria 18
• 3.2 Survival of Lactobacillus in extreme acidic condition 19
• 3.3 Stress responses of Lactobacillus in other environmental condition 20
• 3.4 Expression of atpD gene in acidic condition 21
• 3.5 Addition of the substrate for improvement acid resistance 22
• 4. Heavy metal removal by Lactobacillus spp. 23
• 4.1 Confirmation of Heavy metal resistance and minimum inhibitory concentration (MIC) 23
• 4.2 Heavy metal removal assay 24
• 4.3 Antibiotic resistance assay 25
• 5. Characterization of properties for probiotics 26
• 5.1 Assessment of Lactobacillus strains as probiotics 26
• 5.2 Accelerated storage testing 27
• 5.3 Large-scale cultivation 27
• Ⅲ. 결과 및 고찰 28
• 1. Stimulation of C. butyricum growth by Lactobacillus spp. 28
• 1.1 Stimulation of C. butyricum growth by lactic acid bacteria 28
• 1.2 Stimulation of C. butyricum growth according to the initial dose ratio of C. butyricum and lactic acid bacteria 33
• 1.3 Expression of butyric acid producing gene of C. butyricum in co-culture with Lactobacillus spp. 36
• 1.4 Characterization for probiotics 39
• 1.5 Accelerated storage testing for freeze-dried Lactobacillus strains 43
• 1.6 Large-scale culture of L. parabuchneri MH44 45
• 2. Resistance of Lactobacillus in acidic conditions 47
• 2.1 Assessment of acid resistance to lactic acid bacteria 47
• 2.2 Survival of Lactobacillus in extreme acidic condition overtime 51
• 2.3 Morphology of Lactobacillus in acidic condition 53
• 2.4 Expression of atpD gene in acidic condition 55
• 2.5 Addition of the substrate for improvement acid resistance 58
• 2.6 Stress responses of Lactobacillus in other environmental condition 61
• 2.7 Chacterization for probiotics 64
• 2.8 Accelerated storage testing for freeze-dried Lactobacillus strains 67
• 2.9 Large-scale culture of L. johnsonii MH33 and gasseri KLB240 69
• 3. Heavy metal removal activities of Lactobacillus spp. 71
• 3.1 Heavy metals resistance of Lactic acid bacteria 71
• 3.2 Heavy metal removal by lactic acid bacteria 74
• 3.3 Antibiotic resistance pattern of lactic acid bacteria 77
• 3.4 Chacterization for probiotics 80
• 3.5 Accelerated storage testing for freeze-dried Lactobacillus strains 83
• Ⅳ. 결론 85
• Ⅴ. 참고 문헌 87