Osteogenic Potential of Human Induced Pluripotent Stem Cells and Human Mesenchymal Stem Cells = 사람만능줄기세포와 사람간엽줄기세포를 이용한 골분화 유도에 관한 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow have a potential for cell therapy and tissue engineering. MSCs have already been used for clinical trials because these cells have regeneration and immuno- suppressive properties. A number of studies have confirmed that MSCs cultured in scaffolds can induce osteogenesis in vivo and improve healing of critical-size defects. In addition, engineered stem cells, known as induced pluripotent stem cells (iPSCs), generated from somatic cells by transduction of defined reprogramming factors, typically OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC, open a new avenue to avoid the controversy of using human embryonic stem cells (hESCs). In the present study, we generated of mesodermal cell lineages from hiPSCs following treatment of embryoid bodies (EBs) with retinoic acid. Subsequently, we induced osteogenic differentiation from EBs using osteogenic medium. To avoid the potential safety issues associated with using viruses, we used the hiPSC line by direct delivery of four proteins fused to a cell penetrating peptide in present study.
The purpose of this study was to examine the in vitro induction of osteogenesis of hiPSCs (human induced pluripotent stem cells) and in vivo repair of bone defects comparable to that of hBMMSCs (human bone marrow mesenchymal stem cells) and therefore to prove the usefulness of hiPSCs as a cell source for bone regeneration. EBs which were formed from undifferentiated hiPSCs were dissociated into single cells and underwent osteogenic differentiation using the same medium as hBMMSCs for 14 days. The osteogenic marker gene and protein expression including COL1A1, Runx2, and bone sialoprotein (BSP) increased after 7 days and expression level of gene and protein after 14 days was higher than 7 days by RT-qPCR, western blot and immunohistochemistry. Osteogenic differentiation was also demonstrated via alkaline phosphatase staining and mineralization via Alizarin red staining compared to hBMMSCs. Staining results were similar to expressions of osteogenic markers. Osteo-induced hiPSCs were implanted on the critical-size 4mm calvarial defects created in the parietal bone of immunosuppressed rats with fibrin and hydroxyapatite/ß-tricalcium phosphate (HA/ß-TCP) and 4mm long bone segmental defects created in the radius bone of immunosuppressed rats. The healing of defects was evaluated after 8 weeks and 12 weeks of implantation respectively. The rats received daily injections of cyclosporin A to suppress immune responses in rats.
In conclusion, despite delayed in vitro osteogenesis, hiPSCs have an in vivo osteogenic potential as good as hBMMSCs.

국문 초록 (Abstract)

간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)는 골수에서부터 유래한 줄기세포로 조직공학과 세포치료제로의 가능성을 지니고 있다. 간엽줄기세포는 재생과 면역억제의 특징 때문에 이미 임상실험으로 이용되고 있다. 많은 연구에서 지지체에서 배양한 간엽줄기세포가 생체 내에서 골분화를 유도하고 결손부분의 치유능력을 향상시켜 준다는 것을 밝혀냈다. 또한, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)로 알려진 조작된 줄기세포는 주로 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC의 리프로그래밍 인자들이 체세포에서 형질도입 되어 만들어진다. 이러한 유도만능줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell)의 단점을 보안할 수 있는 새로운 길을 열었다. 현재 연구에서, 우리는 retinoic acid를 이용하여 배아유사세포덩어리를 만들어서 사람유도만능줄기세포를 간엽세포 계통의 세포로 만들었다. 또한 골분화 유도 배지를 이용하여 배아유사세포덩어리를 골분화로 유도하였다. 바이러스를 이용하여 만든 사람유도만능줄기세포는 안전성 문제가 제기 될 수 있으므로 이를 피하기 위하여 네 가지 단백질을 세포에 직접적으로 이동시켜서 만든 사람유도만능 줄기세포를 사용하였다. 이 연구의 목적은 in vitro 에서 사람유도만능줄기세포를 이용한 골분화의 유도와 in vivo에서 뼈 절단부분의 조직 재생능력을 사람간엽줄기세포와 비교하고 조사하는 것이다. 이러한 연구를 통해 사람유도만능줄기세포가 골 재생에 사용될 세포 자원으로써의 사용 가능성을 증명하는 것이 이 연구의 목적이다. 분화되지 않은 사람유도만능줄기세포로 만든 배아유사세포덩어리를 단일 세포들로 분리한 후 사람간엽줄기세포와 마찬가지로 골 분화 유도 배지를 이용하여 14일간 골 분화를 유도 하였다. 골 분화가 유도된 사람유도만능줄기세포를 면역억제 쥐의 두정골에 임계크기로 calvarial defect을 준 부위에 fibrin과 hydroxyapatite/ß-tricalcium phosphate (HA/ß-TCP)와 함께 섞어 이식하였다. 또한 면역억제 쥐의 요골에 4mm의 뼈 절단하여 그 부위에 골 분화가 유도된 사람유도만능줄기세포를 fibrin과 함께 섞어 이식하였다. 절단 부분의 치유된 정도는 이식 후 calvarial defect은 8주, 4mm 요골 절단은 12주 이후에 확인하였다. 쥐의 면역반응을 억제 하기 위해 매일 cyclosporin A를 주입하였다.
골 형성 마커인 COL1A1, Runx2, BSP의 유전자와 단백질 발현이 7일 분화 시켰을 때 증가하였고, 14일 분화 시켰을 때는 7일 분화 시켰을 때 보다 발현 level이 더 높았다. 골분화를 유도시킨 사람유도만능 줄기세포는 사람간엽줄기세포와 비교하였을 때 골 형성 마커인 COL1A1, BSP의 in vitro 발현이 상대적으로 더 낮고 지연되는 것으로 보인다. 하지만 골 분화를 유도시킨 사람유도만능줄기세포는 사람간엽줄기세포와 큰 차이를 보이지는 않았다. 또한, Runx2 유전자 발현은 사람간엽줄기 세포보다 사람유도만능줄기세포에서 훨씬 더 높은 level을 나타내었다. 골 분화를 확인 하는 실험으로 또한 alkaline phosphatase staining과 alizarin red staining, mineralization을 통해서도 사람간엽 줄기세포와 비교하여서 실험하였다. 염색 결과는 골 형성 마커의 발현과 비슷한 결과를 나타내었다.
In vivo histology는 micro-CT, Goldner’s trichrome staining, 면역조직화학적 염색을 통해 평가하였다. 사람유도만능줄기세포를 이식한 calvarial defects에서 새로운 뼈가 뼈 두께나 trabeculae의 형성으로 보아 사람간엽줄기세포를 이식한 calvarial defects과 비슷한 수준으로 형성되었다. Goldner’s trichrome staining으로 fibrin과 HA+ß-TCP와 함께 이식한 사람유도 만능줄기세포의 골 조직 재생을 확인하였다. 또한, 면역조직화학적 염색을 통해 human nuclear antigen이 새로 생겨난 뼈에서 확인되었고, human cell이 사람만능줄기세포와 사람간엽줄기세포를 이식한 defect부분에서 관찰되었다. 사람유도만능줄기세포와 사람 간엽줄기세포 모두 이식 후 8주 후에 골 조직재생을 확인하였다. Long bone segmental defect에서는 매 3주마다 X-ray를 통해 defect 부분의 재생을 확인하였고, 12주 후 사람유도만능 줄기세포를 이식한 그룹에서도 사람간엽줄기세포를 이식한 그룹과 비슷한 수준으로 segmental defect부분에서 골 재생이 이루어 졌다.
결론적으로, 이 연구에서는 in vitro에서 유도만능줄기세포를 간엽줄기세포로 직접적으로 분화시키고 골 분화를 성공적으로 이루어 냈다. 이러한 결과들은 in vitro에서 사람유도만능 줄기세포를 골세포로 만들 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, in vivo 실험을 통해서 골분화를 유도시킨 사람유도만능줄기세포의 이식은 bone defect을 치유 할 수 있다는 것을 증명하였다. 사람유도만능 줄기세포를 이용한 더 나은 in vivo 골 조직재생을 위해서 사람 유도만능줄기세포 이식에서의 mechanism과 strategy에 대해 더 많은 연구가 이루어 져야 할 것이다. In vitro에서 사람유도 만능줄기세포의 골분화가 사람간엽줄기 세포보다는 지연 되지만 in vivo에서는 사람유도만능줄기세포가 사람간엽줄기세포와 같은 골 조직재생 가능성을 지니고 있다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction = 1
• 1-1. Bone regeneration = 1
• 1-2. Mesenchymal stem cells (MSCs) = 4
• 1-3. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) = 5
• 1-4. Reprogramming methods of iPSCs = 7
• 1-5. Strategies for reprogramming of iPSCs = 8
• 2. Material and Methods = 11
• 2-1. hiPSC culture = 11
• 2-2. Differentiation into Embryoid Bodies = 12
• 2-3. Induction of Osteogenic Differentiation = 13
• 2-3-1. Osteoblast culture of hiPSCs = 13
• 2-3-2. Isolation and cultivation and in vitro osteogenic differentiation of hBMMSCs = 14
• 2-4. Alkaline phosphatase (ALP) staining = 15
• 2-5. Alizarin red staining = 15
• 2-6. RT-qPCR = 16
• 2-7. Western Blot Analysis = 17
• 2-8. Goldner’s trichrome staining = 17
• 2-9. Immunohistochemstry = 18
• 2-10. Surgery and transplantation procedure = 19
• 2-10-1. Calvarial defect model = 19
• 2-10-2. Segmental defect model = 20
• 2-10-3. Macroscopic observation and histology = 21
• 2-11. Statistical Analysis = 22
• 3. Results = 23
• 3-1. Disappearance of ESC markers and appearance of osteogenic markers in osteo-induced hiPSCs = 23
• 3-2. In vitro osteogenic differentiation of hiPSCs vs hBMMSCs = 26
• 3-3. Healing of critical-size calvarial defect by the implantation of hiPSCs = 31
• 3-4. Healing of critical-size long bone segmental defect by hiPSCs = 34
• 4. Discussion = 36
• 5. Conclusion = 39
• Reference = 40
• 국 문 초 록 = 47