유전자 편집 전분화능줄기세포의 테트라사이클린-조절 시스템이 조혈모세포, 내피세포, 신경전구세포로의 분화 과정 중 보이는 유전자 침묵(gene silencing)에 관한 연구 = A Study on Gene Silencing Observed During Differentiation of Hematopoietic, Endothelial, and Neural Progenitor Cells in Tetracycline-Regulated Systems of Genetically Edited Pluripotent Stem Cells

국문 초록 (Abstract)

유도만능줄기세포(iPSC)는 체세포를 재프로그래밍해 배아와 유사한 전분화 능력을 갖는 세포로, 재생의학 및 세포치료 분야에서 획기적인 돌파구를 제공하고 있다. iPSC는 조혈모세포(HSC), 내피세포(EC), 신경전구세포(NPC) 등 다양한 세포 계통으로 분화할 수 있어, 유전자 편집 및 맞춤형 세포 치료제 개발에 중요한 플랫폼으로 주목받고 있다. 그러나 유도만능줄기세포를 분화시키는 과정에서 도입된 형질전환 유전자가 발현되지 않는 유전자 침묵(transgene silencing) 현상은 세포 치료제의 효능과 안전성에 큰 도전 과제로 작용한다.

본 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 활용해 AAVS1 safe harbor locus에서 유전자 편집을 수행한 유도만능줄기세포를 다양한 세포 계통으로 분화시키고, 분화 과정에서 발생하는 유전자 침묵 현상을 분석하였다. 특히, 테트라사이클린 유도성 시스템을 형질도입한 유도만능줄기세포에서 분화 후 특정 시점에 유전자가 침묵되는 현상을 확인하였으며, 이러한 침묵 현상이 세포 유형 및 분화 경로에 따라 달라지는 것을 관찰하였다. 이를 해결하기 위해 소디움 뷰티레이트(sodium butyrate) 및 아자시티딘(azacitidine)과 같은 후성유전학적 저분자 억제제를 처리하여 유전자 침묵을 완화하고, 분화된 세포에서 안정적인 유전자 발현을 유지하는 전략을 탐구하였다.

이 연구는 유도만능줄기세포의 유전자 편집 및 분화 과정에서 발생하는 후성유전학적 변화와 유전자 발현 패턴을 심층적으로 분석하고, 유전자 침묵을 극복하기 위한 새로운 접근법을 제시한다. 이러한 접근은 유전자 편집 유도만능줄기세포 기반의 세포 치료제 개발 및 임상 적용에서 신뢰성과 효율성을 높이는 데 기여할 것으로 기대된다. 나아가, 본 연구는 후성유전학적 조절 기법을 활용해 유전자 발현을 장기적으로 유지하고, iPSC 기반 맞춤형 치료제 개발을 가속화하는데 중요한 기반을 마련한다.

핵심되는 말: 유전자 편집, 테트라사이클린 유동성 시스템, 유전자 침묵, 유도만능줄기세포, 조혈모세포, 내피세포, 신경전구세포, 소디움 뷰티레이트, 아자시티딘

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized the fields of regenerative medicine and cell therapy by providing a virtually unlimited source of cells capable of differentiating into various lineages, including hematopoietic stem cells (HSCs), endothelial cells (ECs), and neural progenitor cells (NPCs). iPSCs play a pivotal role as platforms for gene editing and the development of personalized cell-based therapies. However, transgene silencing during differentiation remains a significant challenge, potentially compromising the efficacy and safety of cell therapies.

In this study, we utilized the CRISPR/Cas9 system to perform gene editing at the AAVS1 safe harbor locus in iPSCs and analyzed transgene silencing during their differentiation into various cell lineages. Notably, we observed transgene silencing in iPSCs with a tetracycline-inducible system following differentiation, with suppression patterns varying depending on cell type and differentiation pathways. To address this issue, we investigated the use of epigenetic small-molecule inhibitors such as sodium butyrate and azacitidine to mitigate gene silencing and maintain stable transgene expression in differentiated cells.

This study provides a comprehensive analysis of epigenetic changes and gene expression patterns during the differentiation of gene-edited iPSCs, offering new insights into overcoming transgene silencing. Our findings are expected to enhance the reliability and efficiency of gene-edited iPSC-based cell therapies in clinical applications. Furthermore, this research lays the foundation for long-term maintenance of transgene expression through epigenetic regulation, accelerating the development of personalized iPSC-based therapeutics for a wide range of diseases.

Key words: Gene editing, tetracycline-inducible system, transgene silencing, induced pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, endothelial cells, neural progenitor cells, sodium butyrate, azacitidine

목차 (Table of Contents)

• 그림 및 표 차례
• 국문요약
• Ⅰ. 서론························9p
• Ⅱ. 연구방법······················16p
• 1. 나노 루시페레이즈 분석(Nluc assay, Nano luciferase assay) ························16p
• 2. CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 세포 주 확립 ·····17p
• 3. 줄기세포 배양 및 분화 ··············23p
• 4. 유세포 분석 (FACS, Fluorescence-Activated Cell Sorting) ························28p
• 5. 자기활성 세포 분리(MACS, Magnetic-Activated Cell Separation)···················29p
• 6. 통계적 분석···················30p
• Ⅲ. 결과························31p
• 1. 유전자 편집 만능유도줄기세포의 분화 과정에서 발생하는 유전자 침묵: 조혈모세포, 내피세포, 신경전구세포 ·······31p
• 2. 소디움 뷰티레이트 및 아자시티딘을 통한 유전자 침묵 재활성화 효능 평가····················42p
• Ⅳ. 고찰························50p
• Ⅴ. 결론·······················51p
• 참고문헌·······················53p
• 영문요약·······················55p