건강기능식품 기능성원료로서 시계꽃추출물분말의 지표성분 Vitexin 분석법 = Analytical Method Validation of Vitexin in Passiflora incarnata Extract Powder as a Functional Ingredient for Functional Health Food|RISS 상세보기

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

A sleep disorder is a condition in which a person is unable to take a sleep or is disturbed when sleeping because of a disturbed sleep rhythm, and includes symptoms such as insomnia, narcolepsy, restless legs syndrome, snoring, sleep apnea. According to the domestic research trend analysis of sleep disorder, 31% of the adults reported difficulty in sleeping, frequent sleeping, and early awakening, and 56.9% of the elderly reported a change in sleep patterns compared to the younger ones. People are experiencing a surge in sleep disorder patients due to excessive stress and use of smartphones. There is much interest in functional materials that have been validated to relieve symptoms of sleep disorders and to prevent chronic diseases.
Passionflower are perennial plants grown in the subtropical and tropical regions of perennial plants. Passiflora species contain several compounds, including alkaloids, phenols, glycosyl flavonoids, and cyanide compounds. Passiflora incarnata's representative C-glycoside flavonoids include vitexin, isovitexin, orientin, and isoorientin. Vitexin is a flavonoid glycoside, a compound found in Passionflowers, Vitexin agnus-castus, Phyllostachys nigra bamboo leaves and Hawthorn. Passionflowers have been shown to stabilize the nerves and to stabilize the nerves and have proved effective as traditional herbal sedatives, anxiolytics and sleep aids widely used in the treatment of sleep disorders. For the standardization of passionflower extract powder containing various physiological functions, vitexin, a flavonoid compound, was set up as an index component. HPLC method was used to establish the analytical method of vitexin as an indicator and to perform validation.
Standardization in the development and production of health functional foods is very important. Standardization refers to a good manufacturing process standard to reduce the minimum difference in processing from raw material to finished product in order to maintain the target component in the manufacturing process. The standardization method of the marker component is most commonly used. The marker component is present in natural products and is selected for standardization. It is a standard component of standardization based on the stability, the ease of analysis technology, time and cost analysis, researchers and developers, should be performed.
In order to verify the Vitexin assay, specificity, accuracy, precision, linearity, detection limit, quantitation limit and recovery rate were analyzed based on 'Guideline for Validation of Analytical Methods such as Drugs'. Specificity was determined by HPLC analysis of vitexin standard solution and pretreated Passionflora incarnata extract powder to determine retention time and photo diode array (PDA) spectrum on chromatogram to show the same spectrum. The accuracy measures the variability of intra-day and inter-day analyzes. The reproducibility of HPLC analysis was confirmed by intra-day and inter-day analyzes of vitexin (10, 25 and 50 μg/mL). Accuracy was measured three times repeatedly at three concentrations of the prepared standard, and the percentage of the result close to the true value was expressed as a percentage. Intra-day was divided into 3 sections, and inter-day was conducted for 1 day and 1 section. Precision was measured by repeating the standard solutions at 10, 25 and 50 ㎍/mL six times, respectively, relative standard deviations. Relative standard deviation (RSD) was calculated as a percentage by dividing the standard deviation by the mean. The standard solution was diluted stepwise with 1~50 ㎍/mL and analyzed by HPLC. A calibration curve was drawn for the area of concentration, and the linearity was confirmed as r2 value. In addition, the signal to noise (S/N) ratio of the peaks at each concentration was determined with the standard calibration curve, and the limit of detection was calculated when the S/N ratio was 3.3 and the detection limit and S/N ratio were 10. For the recovery, three concentrations of standard solutions (10, 25 and 50 ㎍/mL) were added to a blank (vitamin drink) that did not contain vitexin by the pretreatment method used in this study. The area obtained by HPLC analysis was compared with the area of the standard solution and the recovery was calculated as a percentage using the mean and relative standard deviation (RSD).
Validation of vitexin as a marker compound in the standardization of Passiflora incarnata extract powder developed for functional health food was attempted by analytical method. The specificity was satisfied with retention time and photo diode array (PDA) spectrum by analysis of vitexin using HPLC and comparison with standard compound. RSD value of accuracy in intra-day was less than 0.98%, and inter-day was less than 1.36%, respectively. In the precision measurement reults, the RSD was 0.62~0.84%. It showed a high linearity in the calibration curve as coefficient of correlation (R2) of 0.9998, and the limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were 0.01 ㎍/mL and 0.03 ㎍/mL, respectively. Recovery rate test with vitextin concentration of 10, 25 and 50 ㎍/mL was revealed 95.07~95.46%, 96.51~97.03% and 96.73~97.48%, respectively. Therefore, application of vitexin was validation in analytical method as a marker compound in Passiflora incarnata extract powder. The content of vitexin in Passiflora incarnata extract powder was found to be 2.52 mg/g. In addition, it was confirmed that malto dextrin and silicon dioxide excipients did not interfere with the analysis. Therefore, it is considered that the vitexin method, which has been established through this study, will be used as a basic data for the development of functional ingredients for health functional foods, each of which is a Passiflora incarnata extract powder.

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국문 초록 (Abstract)

수면장애(sleep disorder)란 건강한 수면을 취하지 못하거나, 수면리듬이 흐트러져 있어서 잠자거나 깨어있을 때 어려움을 겪는 상태를 말하는 것으로 불면증, 기면증, 하지불안증후군, 코골이, 수면무호흡증 등의 증상을 포함한다. 수면장애에 관한 국내연구 동향분석에 따르면 일반성인의 31%가 때때로 입면곤란, 자주 깸, 너무 일찍 깨는 등의 수면곤란을 호소하였으며, 56.9%의 노인이 젊었을 때에 비해 수면양상의 변화를 보고하였다. 현대인들은 과도한 스트레스와 스마트폰의 사용 등의 이유로 수면장애 환자가 급증하는 추세이다. 이러한 수면장애 증상을 완화하고 만성질환을 예방하기 위해 유효성이 검증된 기능성 소재에 많은 관심을 두고 있다.
시계꽃은 여러해살이풀로 아열대와 열대지역에서 재배되고 있는 다년생 상록덩굴식물이다. Passiflora 종은 알칼로이드, 페놀, 글리코실 플라보노이드 및 시안화 화합물을 포함한 여러 가지 화합물을 함유하고 있다. Passiflora incarnata의 대표적인 C-glycoside 플라보노이드 종류에는 vitexin, isovitexin, orientin, isoorientin 등이 있다. Vitexin은 시계꽃, Vitexin agnus-castus, Phyllostachys nigra 대나무 잎 및 Hawthorn에서 발견되는 화합물인 플라보노이드 글리코시드이다. 시계꽃은 경련을 조절하는 기능을 갖고 있고, 신경을 안정시킨다고 보고되었으며 전통적인 허브 진정제, 불안 완화제 및 수면장애 치료에 널리 사용되는 수면 보조제로서 효능이 입증되었다. 이러한 다양한 생리적 기능성을 함유한 시계꽃추출물분말의 표준화를 위해 지표성분으로 플라보노이드 화합물인 vitexin을 설정하였으며, HPLC를 이용하여 지표성분 vitexin의 분석법을 확립하고 그에 따른 유효성 검정을 실시하고자 하였다.
건강기능식품을 개발, 생산 시 표준화 및 규격화는 매우 중요한 부분을 차지하게 된다. 표준화는 제조공정에서 목표하는 성분을 유지하기 위하여 원재료에서 최종제품까지 가공하는데 최소한의 차이를 줄이기 위한 우수제조공정 규범을 말하며 이때 지표성분의 표준화 방법이 가장 일반적으로 사용되게 된다. 지표성분은 천연물에서 존재하며 표준화를 위해 선택되는 성분으로써 안정성, 분석기술의 용이성, 시간과 비용 측면의 분석, 연구자 및 개발자를 고려하여 이전부터 사용했거나 사용한 분석을 근거로 하여 지표성분에 대한 표준화를 수행하여야 한다.
Vitexin 분석법을 검증하기 위하여 ‘의약품 등 분석법의 밸리데이션에 대한 가이드라인’을 근거로 하여 특이성(specificity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD, S/N=3.3) 및 정량한계(limit of quantitation, LOQ, S/N=10), 회수율(recovery)을 분석하였다. 특이성(specificity)은 vitexin 표준용액과 전처리한 시계꽃추출물분말을 HPLC로 분석하여 크로마토그램상의 retention time과 PDA(photo diode array) spectrum을 측정하여 동일한 spectrum을 나타내는지를 확인하였다. 정확성(accuracy)은 일내분석(intra-day)과 일간분석(inter-day)의 변이성을 측정하였다. 표준용액 vitexin을 10, 25, 50 ㎍/mL로 조제하여 일내분석(intra-day)과 일간분석(inter-day)에서 HPLC 분석의 재현성을 확인하였다. 정확성은 조제한 3개 농도의 표준품을 3회 반복 측정하여 결과값이 참값에 근접한 정도를 백분율로 나타내었다. Intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였으며, inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였다. 정밀성(precision)은 10, 25, 50 ㎍/mL 농도의 표준용액을 각각 6회 반복하여 상대표준편차를 측정하였다. 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)는 표준편차를 평균으로 나누어 백분율로 계산하였다. 표준용액을 1~50 ㎍/mL의 단계적으로 희석하여 HPLC로 분석한 후 농도에 대한 면적에 대하여 검량선을 작성하고, r2값으로 직선성(linearity) 확인하였다. 또한 작성된 표준검량선으로 각 농도별 peak의 Signal to Noise(S/N) ratio를 구하여 S/N ratio가 3.3이 될 때 검출한계, S/N ratio가 10이 될 때 정량한계를 계산하였다. 회수율(recovery)의 경우 본 연구에서 사용한 전처리법을 이용하여 vitexin이 함유되어 있지 않은 공시료(비타민 음료)에 표준용액 10, 25, 50 ㎍/mL의 세 가지 농도를 각각 첨가하여 회수율 실험을 실시하였다. HPLC로 분석하여 얻어진 면적을 표준용액의 면적과 비교하여 평균과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)을 이용하여 백분율로 회수율을 계산하였다.
유효성 검정 결과, 본 시험법에서 표준용액의 피크유지시간과 시계꽃추출물분말의 피크유지시간이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내어 특이성을 확인하였다. 정확성 측정 결과 intra-day에서의 RSD는 0.98% 이하, inter-day에서는 1.36% 이하로 나왔다. 정밀성 측정 결과에서는 RSD는 0.62~0.84% 였다. 검량선의 상관계수(r2)는 0.9998로 높은 직선성을 보여 분석에 적합함을 알 수 있었으며, S/N ratio에 따른 검출한계는 0.01 ㎍/mL, 정량한계는 0.03 ㎍/mL로 설정되었다. Vitexin의 회수율은 10 ㎍/mL에서는 95.07~95.46%, 25 ㎍/mL은 96.51~97.03%, 그리고 50 ㎍/mL의 농도에서는 96.73~97.48% 범위의 회수율을 보였다. 그러므로 HPLC를 이용한 시계꽃추출물분말의 지표성분인 vitexin의 분석법은 적합한 시험법임이 검증되었다. 시계꽃추출물분말의 vitexin 함량을 본 시험법에 따라서 분석한 결과, 5개 lot별 3회 반복 분석하였을 때 평균 2.52 mg/g 이었다. 추가적으로 말토덱스트린, 이산화규소 부형제가 분석에 간섭하지 않음을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통하여 확립된 vitexin의 분석법이 시계꽃추출물 개별인정형 건강기능식품 기능성 원료 개발을 위한 기초자료로 활용될 것으로 사료된다.

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수면장애(sleep disorder)란 건강한 수면을 취하지 못하거나, 수면리듬이 흐트러져 있어서 잠자거나 깨어있을 때 어려움을 겪는 상태를 말하는 것으로 불면증, 기면증, 하지불안증후군, 코골이, ...

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