SOX2 증폭이 있는 폐편평세포암 세포주에서 THZ1 투여의 효과

국문 초록 (Abstract)

배경 및 목적: CDK억제제는 CDK의 기능을 억제하는 모든 화합물을 통칭하는 것으로써 암세포의 과증식을 억제함으로써 암의 치료에 사용되어지고 있다. CDK억제제는 표적의 특이성에 기초하여 분류되며, 현재 적어도 10종류 이상의 CDK 억제제가 임상실험을 진행 중이다. 이들 대부분은 여러 CDK를 동시에 표적으로 억제하는 형태이고 특정 암에서는 제 2임상실험까지 진행 중이다. 최근에 THZ1 으로 명칭 되어지는 CDK7 억제제가 소개되어, 이미 폐소세포암에서는 쥐와 인간의 전임상시험 을 통해 특별한 부작용은 나타내지 않으면서 종양의 크기를 감소시키면서 기존의 항암제에 비해 우수한 효과를 보여 주었다. THZ1의 기전에 대해 연구하던 중 super-enhancer 연관 유전자가 특히 THZ1에 취약한 것을 관찰할 수 있었고, 그중에 중요한 인자가 Sex-determining region Y (Sry)-related high mobility group (HMG)-box (SOX)2임을 발견하였다. THZ1은 암세포에서 전사억제 기전을 통해 RNA 중합효소의 인산화를 억제함으로써 전체적인 mRNA의 발현을 억제하는 작용을 하는 것으로 알려져 있고, SOX2는 배아줄기세포의 전사인자로써 폐의 발달에 중요한 역할을 담당하고 있고, 모든 폐암세포의 조직에서 SOX2 과발현이 입증된바 있다. 한편, 폐편평세포암에서 3q26.3의 과발현은 가장 흔한 유전자 이상으로 알려져 있고 이와 관련되어 SOX2가 그중 중요한 인자임이 이미 알려져 있으나, THZ1을 처리하였을 때 폐편평세포암에서 어떤 영향을 미칠 것인지에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 SOX2 증폭이 있는 폐편평세포암 세포주에서 CDK7억제제인 THZ1의 투여효과를 알아보고자 하였다.
대상 및 방법: 3개의 SOX2 증폭이 있는 폐편평세포암 세포주 (H520, H1703, HCC95), 2개의 SOX2증폭이 없는 폐편평세포암 세포주 (H226, SK-MES1)를 배양하여 THZ1의 농도를 증가시키면서 투여하였고, 각각의 세포주의 생존률은 CCK-8 assay를 이용하여 조사하였다. CDK7과 SOX2관련 단백은 Western blotting을 이용하여 분석하였다. 실제 SOX2가 세포의 생존에 중요한 인자인지를 확인하기 위하여 유전자가위 CRISPR/Cas9 실험기법을 이용하여 SOX2를 선택적으로 제거한 뒤 살펴 본결과, SOX2 증폭이 있는 편평세포암 세포주 (H520, HCC95) 에서 세포사멸이 유도됨을 확인하였다. 추가로, microarray 분석 및 gene ontology를 통해 어떠한 기전에 의해 세포 사멸이 유도되는지를 조사 하였다.
결과: THZ1 처리시 SOX2 증폭이 있는 폐편평세포암 세포주의 경우 용량에 의존하여 생존률이 감소하였으나 SOX2 증폭이 없는 폐편평세포암에서는 생존률 감소가 보다 완만하게 이루어짐을 확인할 수 있었다. SOX2 를 표적으로 유전자가위 (CRISPR/Cas9)를 처리하고 살펴보면 세포사멸이 유도되는 것을 보아 SOX2가 SOX2증폭이 있는 폐편평세포암 세포주에서는 세포의 생존에 중요한 역할을 함을 관찰할 수 있었고, microarray를 통해 THZ1 이 SOX2 증폭이 있는 폐편평세포암 세포주에서 주로 전사억제를 통해 세포사멸을 유도함을 확인하였다.
결론: CDK억제제인 THZ1은 SOX2 증폭이 있는 폐편평세포암에서 전사억제를 통해 세포사멸을 유도하여 치료적 효과를 나타냄을 확인할 수 있었고, 추가적 실험을 통해 항암제의 잠재적인 후보로써의 가능성이 있을 것으로 생각된다

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Aims: Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors are chemicals that inhibit the function of CDKs, and are used to treat cancers, since they prevent over-proliferation of cancer cells. They are categorized based on their target specificity. More than 10 CDK inhibitors are currently undergoing clinical trials, with some showing encouraging results in phase II clinical trials. A specific CDK7 inhibitor, named THZ1, has recently been identified as a drug candidate. In both murine and human preclinical models of small cell lung carcinoma (SCLC), THZ1 showed promising therapeutic effects, reducing tumor growth without overt toxicity. Super-enhancer associated genes were found to be disproportionally vulnerable to THZ1, with being one of the most important super-enhancer associated genes. SOX2, an embryonic stem cell transcription factor, plays an important role in lung development, and its over-expression has been observed in all types of lung cancer cells. In lung squamous cell carcinoma (SqCC), 3q26.3 amplification is one of the most commonly gained gene, and SOX2 is the most influential transcription factor associated with this amplification. We studied the effect of THZ1 treatment on lung SqCC, wherein we have investigated the effect of THZ1 treatment on SOX2-amplified lung SqCC cell lines.
Methods: We compared the effects of THZ1 treatment on SOX2-amplified lung SqCC cell lines (H520, H1703, HCC95) with those on SOX2 non-amplified lung SqCC cell lines (H226, SK-MES1). Cell viability was assessed using the cell counting kit-8 (CCK-8) Assay. CDK7 and SOX2 related proteins were detected by Western blotting using an enhanced chemiluminescence (ECL) substrate. To confirm the key role of the SOX2, we used CRISPR/Cas9 experimental technique, targeting SOX2 gene. Cells were manually collected and counted, and RNA was extracted to evaluate the effect of THZ1 treatment on gene expression. Microarray analysis and gene ontology (GO) were performed.
Results: SOX2-amplified lung SqCC cell lines, but not SOX2 non-amplified lung SqCC cell lines, were inhibited by THZ1. Viability of SOX2-amplified lung SqCC cell lines decreased in a dose-dependent manner after treatment with THZ1, which was not observed in SOX2 non-amplified lung SqCC cell lines. Treating cells with SOX2 CRISPR led to suppression of cell growth and apoptotic cell death in SOX2-amplified lung SqCC cell lines, but not in SOX2 non-amplified lung SqCC cell lines. Transcription associated gene expression, detected by microarray analysis, was decreased in SOX2-amplified lung SqCC cell lines, but not in SOX2 non-amplified lung SqCC cell lines.
Conclusion: THZ1 suppresses SOX2-amplified SqCC cell lines via inhibition of transcription and induction of apoptotic cell death. Therefore, THZ1 is a potential anticancer drug against subtypes of SOX2-amplified lung SqCC.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• II. Materials and Methods 6
• III. Results 10
• IV. Discussion 29
• V. Conclusion 34
• References 35
• 감사의 글 40