Study on reversible non-alcoholic fatty liver disease model using hepatocyte and immune cell co-culture method = 간세포와 면역세포 공배양 기법을 이용한 가역적인 비알코올성 지방간 모델 연구

국문 초록 (Abstract)

비알코올성 지방간은 음주의 여부와 관계없이 고지방 위주의 식사나 비만 및 운동 N부족, 유전적 소인, 제 2형 당뇨병과 같은 여러 가지 원인들로 인해 간세포 내에 지방이 축적되어 생기는 질환이다. 비알코올성 지방간의 증가 추세가 가파르며, 만성 간 질환의 주요 원인으로 대두되고 있다. 지방증과 지방간염은 제때 적절한 치료를 하면 다시 건강한 간으로 회복할 수 있는 가능성이 있지만, 현재까지 규제기관의 승인을 받은 비알코올성 지방간 치료제는 나와있지 않다. 따라서 비알코올성 지방간을 조기예측하고 진단하며, 중재 및 치료를 할 수 있는 연구가 필요하다. 간에 있는 여러 비간질 세포 중 하나인 쿠퍼세포는 간에만 존재하고 있는 면역세포인 대식세포이다. 간이 손상을 입어 쿠퍼세포가 활성화되면, 쿠퍼세포의 수도 증가하고 사이토카인과 같은 염증 매개체들을 분비한다. 따라서 인간 세포주를 이용한 비알코올성 간질환 모델을 만들어 단순한 지방증에서 염증이 동반되는 지방간염까지 모사할 수 모델을 만들고, 시장에 나와있는 항염증 치료제를 모델에 처리함으로써 다시 가역적인 컨디션으로 돌아갈 수 있는지 확인해보고자 했다.
간세포는 HepG2, 쿠퍼세포 대용으로는 THP-1을 사용했다. 두 세포는 공간이 분리된 간소엽의 구조를 최대한 반영하기 위해 트랜스웰을 사용하여 세포 분리를 해주었으며, 의도하지 않은 세포 이동을 막기 위해 THP-1은 생체적합성이 뛰어난 메타크릴레이트화된 젤라틴을 사용해 하이드로젤에 봉입해 주었다. 쿠퍼세포가 활성화 되지 않은 환경을 HepG2와 THP-1의 비율을 10:1로 설정해 Healthy라고 설정했으며, 활성화되어 쿠퍼세포의 수가 늘어나 염증이 동반될 수 있는 환경을 NAFLD라고 칭하며 세포수의 비율은 2:1로 설정했다. 지방증은 고지방 식단에서 가장 흔하게 섭취할 수 있는 올레산과 팔미트산을 사용해 유도시켰다.
ORO 염색을 통해 HepG2에서 두 지방산에 의한 지질 입자의 이상 축적을 확인했으며, 이는 THP-1의 세포수가 증가된 NAFLD 환경의 2:1의 공배양 비율에서 유의적으로 증가했다. 또한 세포 손상을 확인할 수 있는 요소인 활성산소종을 측정한 결과, 지방증과 염증이 동반된 환경에서 더 높은 수치를 보였다. 이를 뒷받침하는 근거로 쿠퍼세포가 활성화되었을 때 분비되는 매개체인 염증성 사이토카인과 간의 성숙화와 관련있는 유전자의 발현양도 확인하였다. 지방간염을 모사한 그룹에서 사이토카인의 발현양이 높게 나타났으며, 간의 기능 기능성 관련 유전자 레벨은 크게 감소하였다. 지방간염을 대변하는 지질 이상 축적과 활성산소종의 수치가 항염증 약물인 프레드니솔론을 처리했을 때 그 수치가 감소하는 것을 확인함으로써 가역적인 비알코올성 지방간 모델을 수립하였다.
더하여 HepG2를 3차원 배양해 증가된 간세포의 기능성을 확인하고 일련의 실험을 수행함으로써, 더 발전된 모델로 나아갈 수 있는 가능성을 제시하였다. 유전자 분석뿐만 아니라 간세포의 단백질 분석과 함께 현재 비알코올성 지방간 환자들에게 처방되고 있는 약물을 처리하는 실험이 추가로 수행되어야 비알코올성 지방간의 후보 치료제가 나왔을 때 효과적으로 적용할 수 있는 모델이 될 수 있을 것이라 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a condition characterized by the accumulation of fat within liver cells, irrespective of alcohol consumption. It arises from various factors such as high-fat diets, obesity, lack of physical activity, genetic predisposition, and type 2 diabetes. NAFLD is increasing rapidly, and is emerging as a major cause of chronic liver disease. While both fatty liver and steatohepatitis can potentially revert to a healthy liver state with appropriate treatment such as exercise and dietary therapy, no ideal medication have been approved medication for NAFLD. Therefore, there is a need for research aimed at early prediction and diagnosis of NAFLD, along with the development of interventions and treatments. Kupffer cells are unique immune cells found in liver, function as macrophages. In response to liver damage, Kupffer cells undergo activation, resulting in an elevated population and the release of inflammatory mediators like cytokines. Therefore, this study aimed to create a NAFLD model using human cell lines that mimics not only simple steatosis but also steatohepatitis, where inflammation is involved. The possibility of reversible the induced steatosis by treating the model with commercially available anti-inflammatory agents.
HepG2 was used as a liver cell, and THP-1 was used as a substitute for Kupffer cells. Since hepatocytes and Kupffer cells are spatially separated in liver lobules, The two cell lines were co-cultured without direct cell-cell contact using transwells. To further ensure spatial separation, THP-1 were encapsulated using highly biocompatible methacrylated gelatin hydrogel. The ratio of HepG2 to THP-1 cells was set at 10:1 in an environment where Kupffer cells remained inactive, "Healthy." In contrast, to create an environment where Kupffer cells were activated, leading to potential inflammation, I referred to it as "NAFLD" and adjusted the cell ratio to 2:1. Steatosis was induced using oleic acid (OA) and palmitic acid (PA), which are most commonly consumed in high-fat diets.
Through OIil Red O (ORO) staining, abnormal accumulation of lipid droplets by the OAPA was confirmed in HepG2, which significantly increased at a co-culture ratio of 2:1 in the NAFLD environment with increased cell numbers of THP-1. In addition, the results of measuring reactive oxygen species (ROS), a factor that confirms cell damage, showed higher levels in an environment accompanied by steatosis and inflammation. To support these findings, the expression levels of inflammatory cytokines, which are mediators secreted when Kupffer cells are activated, and genes related to liver maturation were also confirmed. In the group mimicking steatohepatitis, the expression levels of cytokines were significantly elevated, and the gene levels related to liver functionality showed a marked decrease. Establishing a reversible model of non-alcoholic fatty liver disease was confirmed by observing the reversible reduction of lipid accumulation and reactive oxygen species levels upon treatment with the anti-inflammatory drug prednisolone.
Additionally, by cultivating HepG2 in a three-dimensional setting and confirming the augmented functionality of hepatic cells, this study suggests the potential for a more advanced model. To enhance the model's robustness in validating candidate therapeutics for NAFLD, additional investigations such as hepatic protein analysis and validation with drugs used for existing NAFLD treatments should be conducted.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• 1.1. Non-alcoholic fatty liver disease 1
• 1.2. Hepatocyte and immune cell co-culture system 3
• 1.3. Objectives 4
• Ⅱ. Materials and Methods 6
• 2.1. Materials 6
• 2.2. Cell culture 6
• 2.3. Formation of THP-1 encapsulated 3D hydrogel 7
• 2.4. Preparatiom of fatty acid treatment 8
• 2.5. CCK-8 assay 9
• 2.6. Oil Red O staining 9
• 2.7. Cellular reactive oxygen species assay 10
• 2.8. Real-time PCR 11
• 2.9. Statistical analysis 14
• Ⅲ. Results 15
• 3.1. Design of the in vitro NAFLD model 15
• 3.2. Optimization of OAPA treatment condition 17
• 3.3. Confirmation of lipid accumulation via ORO staining under optimized OAPA concentration 19
• 3.4. Increased lipid accumulation by hepatocyte corresponding to THP-1 co-culture and treatment of fatty acids 21
• 3.5. Synergistic increase in inflammatory response by the presence of co-cultured THP-1 and treatment of fatty acids 26
• 3.6. Synergistic increase in cellular damage by the presence of co-cultured THP-1 and treatment of fatty acids 29
• 3.7. Liver function reduction by the development of NAFLD 31
• 3.8. Reduction in ROS production and lipid accumulation derived from suppressing inflammatory response through prednisolone treatment 34
• 3.9. Further study; cross validation using three-dimensional in vitro model 37
• Ⅳ. Discussion 45
• Ⅴ. References 50
• Ⅵ. Abstract 55
• Ⅶ. 국문요약 59
• Ⅷ. List of Abbreviations 62