고려홍삼의 ERβ 및 PADI4 발현 조절에 의한 신경세포 보호 효과

국문 초록 (Abstract)

알츠하이머나 파킨슨병과 같은 신경변성 질환이 폐경기의 여성이나 남성에게서 더 빈번하게 일어나는 것을 통해 여성의 성호르몬인 에스트로겐의 신경보호 효능이 확인되어 치료의 일환으로 사용되었다. 그러나 호르몬 치료법은 부작용이 심해 대체 약품인 고려홍삼의 사용이 대두되었다. 고려홍삼의 성분이 에스트로겐과 구조적으로 비슷하여 phytoestrogen이라 불리며 이미 널리 알려진 neuroprotective, neurotrophic 약물이다. 그러나 이 효능에 대한 분자생물학적 기작은 불확실하다. 선행 연구에서 microarray를 통해 고정화 스트레스를 받은 생쥐의 뇌에서 peptidyl arginine deiminase type 4 (PADI4) 유전자의 발현이 증가하였고 고려홍삼을 투여한 뒤 스트레스를 받은 생쥐의 뇌에서는 발현이 감소하였다는 것을 확인하였다. PADI4는 류머티즘 관절염과 밀접하게 관련 있는 효소로써 최근 보고에 의하면 PADI4의 발현이 tumorigenesis와 apoptosis라는 상반된 메커니즘을 유도한다고 알려졌으나 PADI4의 정확한 메커니즘은 알려지지 않았으며 스트레스 및 신경세포 분야에서 연구된 바는 없다. 고려홍삼의 신경보호 효능을 in vitro에서 입증하기 위하여 human neuroblastoma (SK-N-SH)에 H2O2를 가한 뒤 ROS를 측정하였다. 스트레스를 받은 세포에서 ROS 발현은 증가하였으나 고려홍삼을 전처리한 세포에 스트레스를 가했을 때 ROS는 감소하였으며 세포 사멸 역시 감소하였다. 그리고 confocal microscopy를 통해 핵 모양을 관찰하였다. 고려홍삼을 전처리한 세포에서는 스트레스를 가한 후라도 고려홍삼을 전처리하지 않은 세포보다 핵 모양이 더 건강하게 유지되었다. 이를 통해 고려홍삼의 신경보호 효능은 항스트레스 효능에 의한 세포 사멸의 저해로 나타난다. 고려홍삼의 항스트레스 효능이 PADI4의 조절에 의한 것인지 확인하기 위하여 SK-N-SH 세포에 산화적 스트레서인 H2O2와 acrylamide, 그리고 tunicamycin을 각각 처리한 후 PADI4 발현을 realtime PCR로 확인하였다. 이 세 가지 스트레서에 의해 시간에 따라 PADI4의 발현은 증가하였고 고려홍삼을 전처리한 세포에서 이 스트레서들에 의해 유도된 PADI4의 발현은 홍삼을 전처리하지 않은 대조군에 비해 낮았다. 주로 뇌와 신경세포에서 발현하는 estrogen receptor β는 에스트로겐에 의해 활성화 되어 estrogen related elements (ERE)의 발현을 조절한다. ERβ는 PADI4 knock down 세포에서 발현 양상의 변화를 보이지 않았고 정상세포에 고려홍삼을 전처리한 군과 전처리군에 스트레스를 가한 군에서 모두 증가하였지만 대조군에서는 감소하였다. 또한 ER antagonist (ER ICI 180780)을 처리 한 뒤 PADI4의 발현은 오히려 고려홍삼 전처리 군에서 증가하여 기존의 양상과 정반대의 양상을 나타내어 ERβ가 PADI4의 발현을 조절할 것으로 추정되었다. PADI4의 신호전달 과정을 규명하기 위하여 PADI4 knock down 세포에 H2O2를 가하고 western blot을 통해 pro-apoptotic, anti-apoptotic 인자들을 확인하였다. H2O2는 control siRNA가 처리된 세포에서 p53, caspase 3, 그리고 phospho JNK의 발현을 유도하였지만 PADI4가 knock down 된 세포에서는 발현이 유의성있게 감소하였다. 그리고 Bcl2의 발현은 고려홍삼을 전처리 한 그룹에서 대조군보다 증가하였으며 특히 PADI4를 knock down한 군에서 control siRNA를 처리한 군보다 더 높은 발현을 보였다. 본 연구를 통해 PADI4의 스트레스 마커로써 사용 가능성을 제시 할 수 있고 사람의 신경세포주에서 고려홍삼의 항스트레스 효능은 ERβ의 활성화로 인해 PADI4가 억제되어 세포사멸을 막음으로써 나타난다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Red ginseng (RG) is a well known neuroprotective and neurotrophic herbal
medicine. Estrogen has been used for neurodegenerative disease but hormone
therapy has many side effects. Therefore, RG, one of the phytoestrogens, is
used as an alternative medicine and also anti-oxidative stress agent. However,
molecular mechanism of RG on these effects remains unclear. Previously,
microarray analysis of mouse brain tissue showed that the peptidylarginine
deiminase type 4 (PADI4) gene expression of immobilization (IMO) stress group
(IMO + PBS only) was increased but that in red ginseng (RG) treated group (IMO + KRG 100 mg) was decreased. The PADI4 gene has been known to be closely related to rheumatoid arthritis (RA), and encodes an enzyme catalyzing the citrullination of arginine residues. High expression of PADI4 was reported in various malignant tumour tissues, and overexpressed PADI4 induces apoptosis and upregulates p21 as well as p53. However, regulation of the PADI4 expression by stress has not been reported. To demonstrate anti-stress effect of RG, H2O2 was added as an oxidative stressor to human neuroblastoma cell (SK-N-SH) ROS and cell death of the cells pre-treated with RG were lower than non-RG treated group. To confirm the PADI4 expression repression by RG, SK-N-SH cells were pre-treated with RG and then exposed to H2O2 as an oxidative stressor. Real time PCR analysis showed that the PADI4 expression
was increased time dependently after exposure to H2O2. Consistently, acrylamide and tunicamycin showed the similar results. These results showed that anti-stress effect of RG in both mouse brain tissue and human neuroblastoma cell line, and the PADI4 can be used as an useful stress marker in various stresses. To investigate how RG affects PADI4 signaling, SK-N-SH cells were treated with PADI4 siRNA and then expression of pro-apoptotic and anti-apoptotic factors was checked after H2O2 stress by Western blot. RG repressed PADI4 induction and subsequently down regulated JNK, p53 and
caspase 3, thus inhibiting apoptosis. To further elucidate ani-stress effect of RG, gene expression of estrogen receptor (ER) and PADI4 in stress condition was
determined. Since estrogen binds to ER, and ERβ is expressed in brain and neuron cells, once ER β is activated by estrogen, it can translocate to nucleus and bind to estrogen related elements (ERE) thus modulating target gene expression. In RG pre-treated cells, ERβ expression was higher than that in non-RG treated cells after exposure to H2O2. However, ERβ expression in PADI4 knock down cells was not different from MOCK transfected cells. In contrast, when cells were treated with ER antagonist (ER ICI 180780), PADI4
expression was abolished indicating that ERβ regulates PADI4. Although exposure to H2O2 increased PADI4 but represssed ERβ, RG pre-treatment reversed these expressions. Taken together, RG treatment represses PADI4 via ERβ resulting in repression of apoptosis and neuroprotection of neuroblastoma cells.

목차 (Table of Contents)

• 논문요약 1
• 제 1 장 서론 3
• 1. 고려인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer) 의 특징 3
• 2. 고려홍삼 (Korean Red Ginseng)의 특징 6
• 3. 스트레스 반응 생리 7
• 1) 스트레스의 정의 7
• 2) 스트레스의 원인과 증상 7
• 3) 스트레스의 반응 기전 9
• 4. 고려인삼 및 홍삼의 항스트레스 및 신경보호 효능 11
• 5. 신경세포와 에스트로겐(Estrogen) 12
• 6. Estrogen Receptors (ERs) 14
• 7. PADI4 (Peptidylarginine deiminase)의 특징 15
• 8. 연구목적 18
• 제 2 장 실험재료 및 방법 19
• 1. 실험재료 19
• 1) Eukaryotic cells 19
• 2) 고려홍삼 농축액 19
• 2. 실험방법 19
• 1) 세포 배양 19
• 2) 고려홍삼 농축액 처리 20
• 3) Cell stress 조건 20
• 4) 용량반응성/MTT assay 21
• 5) PADI4 발현 측정 21
• (1) RNA prep 21
• (2) cDNA 합성 22
• (3) Real-Time PCR 23
• 6) ROS (Reactive oxigen species) 측정 24
• 7) Nucleus morphology 관찰 24
• 8) PADI4 knock down cell구축 24
• 9) Peritoneal macrophage 분리 25
• 10) 세포질과 핵 분리 25
• 11) ER antagonist treatment 26
• 12) ROS inhibitor treatment 26
• 13) Western blot analysis 27
• 14) 통계처리 27
• 제 3 장 실험결과 28
• 1.신경세포에서 스트레스 처리 시 고려홍삼 전처리로 인한 세포 생존율 증가 28
• 2. 고려홍삼 처리 시 여러 가지 스트레스에 대한 PADI4의 발현 억제 31
• 3. 고려홍삼의 세포독성과 항 스트레스 용량 반응성 33
• 4. 고려홍삼 처리 시 다양한 세포에서 PADI4와 p53 발현 감소 36
• 5. 고려홍삼 전처리로 PADI4 감소에 의한 세포사멸 억제 39
• 6. 고려홍삼 처리 시 증가된 NF-kB의 tralslocation 44
• 7. PADI4를 억제하는 ERβ 47
• 8. ERβ knock down 시 증가하는 pro-apoptotic 인자 50
• 9. ROS에 의해 유도되는 PADI4 52
• 제 4 장 고찰 53
• 1. 신경세포에서 고려홍삼의 항 스트레스 효능 확인 53
• 2. 여러 가지 스트레스에 대한 고려홍삼의 항 스트레스 효능 확인 53
• 3. PADI4와 p53의 상관관계 및 고려홍삼의 효능 54
• 4. siRNA를 이용한 고려홍삼의 항 스트레스 작용 55
• 5. 고려홍삼의 신경세포 보호 효능 56
• 6. 작용기전 제시 56
• 제 5 장 참고문헌 59
• Abstract 69