만성 장염에서 장염 활성도에 따른 장내 미생물 조성과 microRNA 발현 및 상호작용 연구 = Gut Microbiota-microRNA Change according to Disease Activity in Chronic Colitis

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background:
Both gut microbiota and micro-RNAs (miRNAs) have been implicated in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. We aimed to investigate the temporal changes and their interactions between gut microbiota and miRNAs according to the disease activity using multi-omics analysis in a murine chronic colitis model.

Methods:
Chronic colitis was induced in the C57BL/6 mice by three rounds of 2.5% DSS exposure. Mice were divided into three groups (n= 8 per group): control group, active group (sacrified at 3 days after the third DSS), and recovery group (sacrificed at 80 days after the third DSS). Clinical activities including weight change and histologic findings of colonic segments were examined. DNA was extracted from mouse feces, and 16S rRNA gene sequencing was performed to evaluate changes in gut microbiota. miRNA expression levels were measured by microarray analysis from mouse colonic tissues. Correlation and network analyses were performed to evaluate the interactions between gut microbiota and miRNAs.

Results:
Alpha diversity indices were increased in the active group compared to control and recovery group. PCoA of metagenomic sequencing showed that the gut microbial profile of the active group was distinctly different from the control group, while the gut microbial profile of the recovery group was similar to the control group. On the other hand, PCoA of miRNA microarray showed that the active group had a significantly different miRNA expression pattern compared to the control group, while the recovery group had a similar miRNA expression pattern to the active group. In taxonomic and miRNA analyses, 147 differential abundant bacterial ASVs and 30 differential expressed miRNAs were identified in the active group compared to the recovery group. Spearman correlation and network analysis between gut microbiota and miRNAs, which showed significant differences between the active and the recovery groups, revealed significant associations between the genera Akkermansia, Turicibacter, Phocaeicola, and Muribaculum and miR-34c-3p, miR-483-5p, miR-200b-3P, and miR-378a-3p.

Conclusions:
In the active phase of chronic colitis, the gut microbial composition and miRNA expression were significantly altered, while in the recovery phase of chronic colitis, the gut microbial profile was similar to that of control, but a significantly different miRNA expression pattern was observed. Specific miRNAs were associated with specific bacterial ASVs, suggesting the interactions between miRNAs and gut microbiota in the development of chronic colitis. Our data suggested significant correlations between the genera Akkermansia, Turicibacter, Phocaeicola, and Muribaculum and miR-34c-3p, miR-483-5p, miR-200b-3P, and miR-378a-3p in the active phase of chronic colitis.

국문 초록 (Abstract)

배경/목적: 장내 세균의 조성 변화를 통한 장내 미생물 불균형은 만성 장염의 병인과 관련되어 있으나 아직까지 염증성 장질환에서 장내 미생물 불균형이 질병의 원인인지는 불분명하다. MicroRNA는 작은 비발현 RNA로 표적 유전자 발현의 전사 후 조절에 관여하는데, miRNA의 이상 발현은 암, 신경 관련 질병, 그리고 염증성 장질환과 같은 자가면역 질환의 질병 발생과 관련이 있다. 그러나 이들의 특이적인 역할과 메커니즘, 직접적인 상호관계는 아직 불분명하다. 만성 장염의 발생에서 microRNA와 장내 세균이 밀접한 관련이 있음은 잘 알려져 있으나 아직까지 이들의 상호작용에 관한 연구는 거의 없다. 이번 연구에서는 장염 모델을 이용하여 만성 장염에서 장염 활성도에 따른 장내 세균 조성과 microRNA의 발현 변화 및 상호작용에 대해 알아보고자 하였다.

방법: 만성 장염을 유도하기 위해 암컷 C57BL/6 마우스에 2.5% dextran sodium sulfate (DSS) 를 5일씩 3차례 반복 투여하였다. DSS를 투여하지 않은 대조군과 3번째 DSS 투여로 가장 장염이 심한 활동기 군, 그리고 3번째 DSS 투여 80일 후 장염이 호전된 회복기 군, 총 3개 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 실험 기간 동안 임상 증상과 체중 변화를 관찰하였고, 마우스 희생 후 장염에 대한 육안 조직학적 평가를 시행하였다. 마우스 대변을 채취하여 DNA를 분리하고 차세대염기서열분석법인 Miseq을 이용하여 메타지노믹 시퀀싱을 수행하였다. 마우스 대장 조직에서 RNA를 분리하여 miRNA microarray를 통해 세 그룹 간 miRNA의 발현 변화를 평가하였다. 장염 활성도에 따라 의미있는 변화를 보인 장내 세균과 miRNA 간의 연관성을 상관 분석 및 네트워크 분석을 통해 평가하였고, RT-PCR을 이용하여 의미있는 장내 세균과 miRNA를 검증하였다. 또한, 대장 조직에서 분리한 RNA를 이용하여 RT-PCR로 다양한 염증 관련 사이토카인 발현 변화를 평가하였다.


결과: 대조군에 비해 DSS를 투여한 두 군에서 체중 감소 및 설사 정도가 심하였으나 회복기 군에선 DSS 투여 4주 후부터 임상 증상이 대조군과 유사한 상태로 회복되었다. 마우스를 희생 후 대장 육안 및 현미경 소견을 평가하였을 때, 활동기 군에선 대조군에 비해 대장 길이가 의미있게 짧았고, 조직학적 염증 점수가 높았던 반면에, 회복기 군에선 대조군과 대장 길이가 유사하였고, 활동기 군에 비해 조직학적 염증 점수가 의미있게 낮았다. 메타지노믹 시퀀싱 분석에서 활동기 군에서 대조군과 회복기 군에 비해 알파 다양성 지수들이 높았고, PCoA 분석에서 활동기 군은 대조군에 비해 확연히 다른 장내 세균 분포를 보인 반면에 회복기 군은 대조군과 장내 세균 분포가 유사하였다. miRNA microarray의 PCoA 분석에서 활동기 군은 대조군에 비해 확연히 다른 miRNA 발현 패턴을 보였고, 회복기 군은 활동기 군과 유사한 miRNA 발현 패턴을 보였다. 활동기 군과 회복기 군 간에 의미있는 차이를 보이는 장내 세균들과 miRNA 간의 상관 분석을 시행하였을 때 Akkermansia 속, Phocaeicola 속과 miR-34c-3p, miR-483-5p, miR-200b-3p, miR-378a-3p 간에 의미있는 관련이 있음을 확인하였다.

결론: 만성 장염의 활동기 군에선 장내 세균 조성과 miRNA 발현이 의미있게 변화한 반면에 만성 장염의 회복기 군에선 정상 대조군에 비해 장내 세균 조성은 유사하였지만, 확연히 다른 miRNA 발현 패턴이 관찰되었다. 또한, 특정 장내 세균들과 특정 miRNAs간에 밀접한 상관관계가 있음을 확인하였는데, 이는 만성 장염의 발생에서 장내 세균과 miRNAs 간의 복잡한 상호작용이 중요한 역할을 할 것이라 추정된다. 이번 연구 결과는 만성 장염의 질병 활성도에 Akkermansia 속, Phocaeicola 속과 miR-34c-3p, miR-483-5p, miR-200b-3p, miR-378a-3p 간의 상호작용이 관련이 있음을 시사하였다.

목차 (Table of Contents)

• 국문요지 ⅲ
• 제1장 서론 1
• 제2장 실험 재료 및 방법 3
• 2.1. 실험동물 대상군 분류 및 DSS를 이용한 만성 장염 유도 3
• 2.2. 육안 소견 및 조직학적 평가 3
• 2.3. 총 RNA 분리 및 miRNA 분석을 위한 miRNA microarray 4
• 2.4. 역전사 중합체 연쇄반응(RT-PCR)을 이용한 사이토카인 발현 평가 5
• 2.5. 마우스 대변 내 세균 DNA 분리와 16S rRNA 유전자 증폭 및 시퀀싱 5
• 2.6. 16S rRNA 유전자 시퀀싱 결과 분석 6
• 2.7. MiRNA와 장내 세균 간의 상관관계 분석 6
• 2.8. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 실시간 중합효소 연쇄 반응(real-time PCR)을 통한 특정 장내 세균 발현 수준과 특정 miRNA 발현 수준 검증 6
• 2.9. 통계 분석 7
• 제3장 결과 8
• 3.1. 만성 장염에서 장염 활성도에 따른 육안 및 조직학적 변화와 사이토카인 발현 변화 8
• 3.2. 만성 장염에서 장염 활성도에 따른 장내 세균 조성 변화 9
• 3.3. 만성 장염에서 장염 활성도에 따른 miRNA의 발현 변화 10
• 3.4. 만성 장염에서 장염 활성도에 따른 장내 세균과 miRNAs의 연관성 분석 11
• 3.5. 반 정량 PCR을 통한 특정 장내 세균과 miRNA 발현 변화의 검증 12
• 제4장 고찰 13
• 제5장 결론 18
• 제6장 참고 문헌 20
• Table 23
• Figure 25
• Abstract 37
• 연구윤리서약서