다양한 환경 요인이 전복의 산화스트레스 반응 및 세포사멸에 미치는 영향 = Effects of Various Environmental Factors on the Oxidative Stress Response and Apoptosis in Disk Abalone Haliotis discus hannai

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Recent industrialization has resulted in a surge in the use of fossil fuels, leading to a continuous increase in atmospheric CO2 concentration. Consequently, marine ecosystems are at risk of being impacted by alterations in water temperature, salinity, and acidification. Exposure to these environmental changes generates reactive oxygen species (ROS) in marine organisms, including powerful oxidizing agents such as superoxide anion radicals (O2−) and hydrogen peroxide (H2O2). Overproduction of ROS in the body results in oxidative stress, leading to a variety of forms of intracellular damage, such as the oxidation of nucleic acids, including DNA, and the promotion of cell death. To counteract the ROS generated in their bodies, organisms employ antioxidant enzymes, such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). During this process, SOD converts O2− to H2O2, while CAT converts H2O2 into harmless water (H2O) and oxygen (O2) molecules. However, even with these antioxidant mechanisms in place, ROS that remain in the body can trigger lipid peroxidation (LPO) and DNA damage, potentially resulting in cell death. In our study, we simulated a complex environmental change scenario by assuming global warming and ocean acidification, both of which are ongoing and projected to persist in the future. Specifically, we exposed abalone Haliotis discus hannai, a marine gastropod, to various environmental stressors, including changes in water temperature, salinity, and pH (salinity + pH, water temperature + pH), and observed their physiological response, including antioxidant activity and cell death, as a means of mitigating oxidative stress.

1. Effect of temperature and pH on oxidative stress and apoptosis in disk abalone
This study analyzed oxidative stress indicators (ROS and MDA), antioxidant enzymes (SOD and CAT), and apoptosis-related genes (caspase-3) in abalone, to investigate the impact of water temperature and pH changes on oxidative stress and apoptosis. Abalone were exposed to a range of water temperatures (15 ℃, 20 ℃, and 25 ℃) and pH levels (7.5 and 8.1) for five days, and in situ hybridization and terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assays were used to visually confirm the effects. Abalone exposed to low/high water temperatures, or a low pH exhibited increased levels of ROS and MDA, with a particularly significant increase observed when low/high water temperatures were combined and a low pH. SOD and CAT expression levels were similarly increased under these complex conditions. The expression of caspase-3, an apoptosis-related gene, was also elevated in the low/high water temperature and low pH conditions, with the highest expression observed when the high temperature was combined with the low pH. Additionally, high levels of apoptosis were detected in abalone exposed to high temperature and low pH conditions. Overall, this study demonstrates that abalone experience an increased expression of antioxidant enzymes and cell death in response to warming temperatures, alone, and in combination with acidification. Specifically, high temperatures promoted cell death by upregulating genes associated with oxidative stress and apoptosis, compared to low pH environments.

2. Effect of salinity and pH on oxidative stress and apoptosis in disk abalone
In In this study, the effects of low salinity and low pH on abalone were investigated by exposing them to a complex environment of 26 PSU and pH 7.5 for 5 days. The degree of oxidative stress, antioxidant enzyme levels (ROS, SOD, and CAT), and osmotic pressure generated in the body of abalone were assessed. Changes in the expression levels of regulation-related genes (Na+/K+-ATPase) and the degree of cell death and DNA damage were also analyzed to determine the effects of salinity and pH changes in abalone. The results showed that the effects of the low salinity and low pH combined to induce significantly higher levels of H2O2 concentration in the hemolymph alongside the expressions of SOD, CAT, and caspase-7 mRNA in the hepatopancreas, compared to the effects of low salinity or low pH alone. As the exposure time elapsed, the degree of DNA damage increased along with caspase-7 mRNA expression. The gill NKA expression and activity, and hemolymph osmolarity were significantly decreased in the low-salinity experimental group. However, there was no significant difference in the NKA expression and activity in the pH 8.1 (control) and low pH experimental groups. These findings suggest that the combined effects of low salinity and low pH can cause uncontrollable levels of ROS-mediated oxidative stress, leading to cell death and DNA damage in abalone.

국문 초록 (Abstract)

최근 산업화로 인한 화석 연료의 사용량 증가와 더불어 대기 중의 CO2 농도가 지속적으로 증가하고 있다. 따라서 해양생태계는 이러한 영향 등으로 인하여 수온 및 염분 변화 그리고 산성화 등의 환경 변화에 직접적으로 노출되어 있는 실정이다. 서식지의 환경 변화에 해양생물이 노출될 경우 체내에서는 superoxide anion radicals (O2−)과 hydrogen peroxide (H2O2)와 같은 강력한 산화력을 지닌 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다. 또한, ROS가 체내에서 과도하게 생성되면 DNA와 같은 핵산을 포함한 각종 세포 내 물질이 산화되거나 세포사멸이 촉진되는 등 다양한 형태로 산화스트레스가 유발된다. 생물체는 superoxide dismutase (SOD)와 catalase (CAT) 등과 같은 항산화효소를 이용하여 체내에서 생성된 ROS를 제거하려는 항산화 메커니즘이 작동되는데, 이 과정에서 SOD는 O2−를 H2O2로 전환시키고 CAT는 H2O2를 무독한 물(H2O)과 산소(O2) 분자로 전환시킨다. 그러나 이러한 항산화 메커니즘의 작동에도 불구하고 체내에서 미처 제거되지 못한 ROS는 지질과산화(lipid peroxidation; LPO) 및 DNA 손상을 유도하여 궁극적으로는 세포사멸로 이어질 수 있다.
따라서 본 연구에서는 현재 진행 중이거나 앞으로도 지속적으로 발생될 것으로 예상되는 지구 온난화 및 해양 산성화 현상을 가정하여 해양생태계에서 실제로 나타날 수 있는 복합 환경 변화 시나리오를 실험구로 설정하여 전복 Haliotis discus hannai을 노출시킨 후 산화스트레스 및 항산화 메커니즘 관련 실험을 진행하였다. 즉, 수온, 염분 및 pH 변화 등의 복합적인 환경(수온+pH, 염분+pH) 하에서 해양 복족류인 전복이 체내에서 발생된 산화스트레스를 제어하기 위한 항산화 반응 그리고 세포사멸을 포함한 다양한 생리학적 반응을 조사하였다.

1. 수온 및 pH가 전복의 산화스트레스와 세포사멸에 미치는 영향
본 연구는 전복을 다양한 수온(15℃, 20℃ 및 25℃) 및 pH(7.5, 8.1)의 복합 환경 조건에 5일간 노출시킨 후 전복 체내에서 발생되는 산화스트레스의 조절 메커니즘을 파악하기 위하여 진행되었다. 산화스트레스 지표로 알려져 있는 ROS와 MDA 그리고 항산화 효소(SOD, CAT) 및 세포사멸 관련 유전자(caspase-3)의 발현 수준을 분석하여 수온 및 pH 변화가 전복의 산화스트레스와 세포사멸에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 수온 및 pH 변화가 전복에 미치는 영향을 가시적으로 확인하기 위하여 in situ hybridization 및 Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay를 통하여 분석하였다.
그 결과, 저∙고수온 또는 낮은 pH의 단일 조건 변화에 노출시킨 전복에서 ROS와 MDA의 증가가 관찰되었으며, 저∙고수온과 낮은 pH의 복합 실험구에 노출시킨 전복에서 특히 ROS와 MDA의 유의적인 증가가 관찰되었다. SOD 및 CAT의 경우에도 ROS 및 MDA의 변화와 유사하게 저∙고수온 및 낮은 pH의 복합 실험구에서 발현량이 유의적으로 증가하였다. 세포사멸 관련 유전자인 caspase-3는 저∙고수온 또는 낮은 pH의 단일 조건에서 발현량이 증가하였으나, 특히 고수온 및 낮은 pH의 복합 실험구에서 유의적으로 가장 높은 발현량을 보였다. 또한, 고수온 및 낮은 pH의 복합 실험구에서 가장 높은 수준의 세포사멸이 발생되었음을 확인할 수 있었다.
본 연구 결과를 종합해 보면, 온난화 단독 조건(고수온)과 온난화와 산성화를 결합한 복합 환경 조건(고수온+낮은 pH) 모두에서 전복의 체내 항산화 효소의 발현량이 증가하였을 뿐만 아니라 세포사멸 또한 발생하였다. 특히, 고수온 환경은 낮은 pH 환경에 비하여 산화스트레스와 세포사멸 관련 유전자의 활성을 증가시켜 세포사멸을 촉진시킨 것으로 판단된다.

2. 염분 및 pH가 전복의 산화스트레스와 세포사멸에 미치는 영향
본 연구는 전복을 저염분(26 psu) 및 낮은 pH(7.5)의 복합 환경 조건에 5일간 노출시킨 후, 전복의 체내에서 발생되는 산화스트레스의 조절 메커니즘을 파악하기 위하여 진행되었다. ROS의 발생 정도는 H2O2 농도로 분석하였으며, 항산화 효소(SOD, CAT) 그리고 삼투압 조절 관련 유전자(Na+/K+-ATPase, NKA)의 발현량을 분석하여 염분 및 pH 변화가 전복의 산화스트레스 반응 및 삼투압 조절에 미치는 영향을 파악하였다. 또한, 염분 및 pH 변화로 인한 전복의 세포사멸 발생 정도를 확인하기 위하여 세포사멸 관련 유전자인 caspase-7 발현량을 조사하였고, comet assay 분석을 통해 DNA의 손상 정도를 확인하였다.
그 결과, 저염분 또는 낮은 pH의 단일 조건 실험구에 비하여 저염분과 낮은 pH의 복합 실험구에 노출시킨 전복의 혈림프에서는 H2O2 농도가 그리고 간췌장에서는 SOD, CAT 및 caspase-7 mRNA 발현이 유의적으로 높게 나타났다. 모든 실험구에서는 노출 시간이 경과함에 따라 caspase-7 mRNA의 발현과 더불어 DNA의 손상 정도가 증가하였다. 또한, 아가미 NKA의 발현과 활성 그리고 혈림프의 삼투압 농도는 저염분 실험구에서 유의하게 감소하였으나, pH 8.1(대조구)과 낮은 pH 실험구에서는 NKA의 발현과 활성이 유의적인 차이를 보이지 않았다.
본 연구 결과를 종합해 보면, 전복은 저염분 또는 낮은 pH의 단일 환경 조건에 노출되는 경우에 비하여 저염분과 낮은 pH의 복합 환경 조건에서 더 많은 스트레스가 유발되었음이 확인되었다.
최근 지속적으로 발생되고 있는 지구 온난화 및 해양 산성화 현상과 같이 다양하고 복합적인 환경 변화에 노출된 전복 체내에서는 제어할 수 없는 수준의 ROS 매개 산화스트레스가 발생될 수 있다. 따라서 전복은 체내에서 발생된 산화스트레스를 제거하기 위하여 항산화 메커니즘을 작동하지만, 그럼에도 불구하고 제거되지 못한 ROS는 세포사멸 및 DNA의 손상을 유발하여 전복에게 악영향을 미칠 수 있을 것으로 판단된다.
해양 복족류인 전복은 국내∙외에서 주요 양식 대상 종으로 알려져 있음에도 불구하고 전복의 산화스트레스 및 항산화 반응 관련 연구는 많이 진행되어 있지 않다. 따라서 본 연구 결과는 최근 지속적으로 발생하고 있는 지구 온난화 및 해양 산성화의 진행에 따라 현실적으로 나타날 수 있는 해양생태계의 환경 변화가 전복에게 미칠 수 있는 분자내분비학적 측면의 정보를 제공할 수 있다는 점에서 의미가 있을 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1 General Introduction 1
• Chapter 2 Effect of temperature and pH on oxidative stress and apoptosis in disk abalone 4
• 2.1. Introduction 4
• 2.2. Materials and methods 7
• 2.2.1. Experimental organism 7
• 2.2.2. Experimental design 7
• 2.2.3. Sampling 11
• 2.2.4. Analysis of hemolymph parameter 11
• 2.2.5. Total RNA extraction and complementary DNA synthesis 11
• 2.2.6. Real-time quantitative polymerase chain reaction 12
• 2.2.7. In situ hybridization detection of SOD mRNA 15
• 2.2.8. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay 16
• 2.2.9. Statistical analysis 17
• 2.3. Results 20
• 2.3.1. Survival of abalones 20
• 2.3.2. Changes in H2O2 and MDA levels in hemolymph 20
• 2.3.3. mRNA expression of antioxidant enzymes 23
• 2.3.4. Expression of SOD mRNA in the hepatopancreas 25
• 2.3.5. mRNA expression of caspase-3 27
• 2.3.6. Apoptosis level in the hepatopancreas 29
• 2.4. Discussion 31
• Chapter 3 Effect of salinity and pH on oxidative stress and apoptosis in disk abalone 35
• 3.1. Introduction 35
• 3.2. Materials and methods 38
• 3.2.1. Experimental organism and tank system 38
• 3.2.2. Experimental design 38
• 3.2.3. Survival and sampling 42
• 3.2.4. Analysis of hemolymph parameter 42
• 3.2.5. Total RNA extraction and complementary DNA synthesis 42
• 3.2.6. Expressions of antioxidative stress and apoptosis gene mRNA 43
• 3.2.7. In situ hybridization detection of NKA mRNA 45
• 3.2.8. Detection of NKA activity in gill 46
• 3.2.9. Detection of DNA damage in hepatopancreas by comet assay 46
• 3.2.10. Statistical analysis 47
• 3.3. Results 48
• 3.3.1. Survival rate 48
• 3.3.2. Changes in NKA of mRNA and protein expression in gill 50
• 3.3.3. Changes in osmolarity in hemolymph 53
• 3.3.4. Change in antioxidant response 55
• 3.3.5. Expression of caspase-7 mRNA in hepatopancreas 58
• 3.3.6. Analysis of DNA damage in hepatopancreas 60
• 3.4. Discussion 62
• Chapter 4 General Discussion 66