Identification and Characterization of Proteins Involved in Phosphorylation and Dephosphorylation of the RsfB Anti-Anti Sigma Factor in Mycobacterium smegmatis = Mycobacterium smegmatis에서 SigF의 anti-anti sigma factor인 RsfB의 인산화와 탈인산화에 관여하는 단백질들의 특성 규명

국문 초록 (Abstract)

Alternative sigma factor인 SigF는 M. smegmatis가 다양한 스트레스 조건에서 적응하기 위해 필요한 인자이다. SigF와 결합하여 이를 격리시키는 anti-sigma factor인 RsbW가 존재하며, RsbW에 결합하여 SigF의 격리를 해소시키는 anti-anti sigma factor로는 RsfA와 RsfB 두 가지가 존재한다. 본 연구에서는 SigF의 기능성을 위해 필요한 RsfB의 활성화와 RsfB의 활성을 조절하는 상위조절자들을 발굴하고 특성조사하였다. Two-component system (MSMEG_6130, sensor histidine kinase; MSMEG_6131, receiver domain containing PP2C phosphatase)을 암호화하는 것으로 추정되며 오페론을 이루는 두 가지의 유전자와 SigF 조절 네트워크에 포함될 것이라 예상되는 rsbW2 (MSMEG_6129)가 M. smegmatis의 rsfB 유전자와 근접한 부위에서 발견되었다. MSMEG_6130과 MSMEG_6131을 RsfS-RsfR이라 명명하여 해당 two-component system이 SigF 조절 네트워크를 구성한다는 가능성을 제시하였다. 선행연구를 통해 RsfB은 Ser63 잔기의 인산화에 의해 불활성화된다는 것을 밝혔으며, RsfB는 RsbW2에 의해 인산화 된다. 또한 Ser/Thr protein kinase를 암호화하는 MSMEG_5437은 RsbW2의 kinase 활성을 증가시킨다는 것을 간접적으로 증명하였다. RsfR은 인산화 되어 불활성화된 RsfB를 탈인산화 시키며, RsfB의 기능성을 회복시켜준다는 것을 확인하였다. rsfS 결실 돌연변이 균주에서 SigF regulon에 속하는 유전자의 발현이 증가하였으므로 RsfS에 의해 인산화 된 RsfR의 phosphatase활성이 감소한다는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 M. smegmatis가 Δaa3 균주 및 영양고갈 조건이라는 스트레스 환경에 대응하기 위해 RsbW2, RsfS, 그리고 RsfR를 이용하여 SigF를 조절한다는 것을 증명하였다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 6
• 1. 재료 6
• 1-1 사용 균주 및 플라스미드 6
• 1-2 사용 배지 및 균주 배양 조건 10
• 2. 방법 11
• 2-1 Polymerase chain reaction (PCR) 11
• 2-2 전기영동 13
• 2.3 Agarose로부터의 DNA 분리 16
• 2.4 Plasmid 분리 및 정제 16
• 2.5 재조합 plasmid 제작 16
• 2.6 Competent cell 제조 17
• 2.7 Transformation 18
• 2.8 단백질 정제 19
• 2.9 β-galactosidase assay 20
• 2.10 RsfB에 특이적인 polyclonal antibody 제작 22
• 2.11 Western blotting 22
• 2.12 In vitro kinase assay 24
• Ⅲ. 결과 25
• 1. SigF 조절에 관여하는 유전자 탐색 25
• 2. SigF 조절에 관여하는 후보군 유전자들에 대한 돌연변이 구축 30
• 3. RsfB anti-anti sigma factor를 인산화 시키는 상위 후보군 유전자들의
• 돌연변이 균주에서 SigF regulon에 속하는 유전자 발현조사 32
• 4. RsfB anti-anti sigma factor를 탈인산화 시키는 상위 후보군 유전자들의
• 돌연변이 균주에서 SigF regulon에 속하는 유전자 발현 조사 35
• 5. RsfB의 In vitro 인산화 여부 조사 40
• 5-1 Phos-tag SDS-PAGE를 이용한 in vitro kinase assay 40
• 5-2 Phos-tag SDS-PAGE를 이용한 in vitro phosphatase assay 41
• 6. Δaa3 균주 및 영양고갈 조건에서의 SigF regulon 발현 증가 42
• 6-1 영양고갈 조건에서의 RsfR의 영향조사 42
• 6-2 Δaa3 균주에서 RsfR의 영향조사 44
• 7. SigF regulon의 발현 정도에 따른 RsfB의 세포 내 인산화 상태 조사 47
• 7-1 영양고갈 조건 및 Δaa3 균주에서의 RsfB 인산화 상태 47
• 7-2 Δ5437, ΔrsbW2, ΔrsfS, 그리고 ΔrsfR 균주에서의 RsfB 인산화 상태 47
• Ⅳ. 고찰 51
• Ⅴ. 참고문헌 56
• Abstract 62
• 감사의 글 63