단감 잎으로부터 항염증 생리활성 성분의 분리 = Purification of anti-inflammatory compounds from the extract of sweet persimmon's leaf

국문 초록 (Abstract)

단감(Diospyros kaki)은 한국과 아시아에서 널리 이용되는 전통적인 과일이며, 단감의 잎은 오래 전부터 동맥경화의 치료제로서 사용되어 왔다. 최근의 연구에서 동맥경화는 혈관의 염증반응과 밀접하게 관련되어 있음이 보고된 것을 바탕으로 단감 잎과 단감 과육으로부터 항염증 활성성분을 추출, 분리하여 그 구조를 밝히고자 하였다. 항염증 활성은 LPS(lipopolysaccharide)가 처리된 RAW 264.7 murine macrophage cell을 사용하여, NO(nitric oxide) 형성이 억제되는 정도를 측정하였다. 단감 잎과 단감 과육의 건조 분말로부터 90% methanol 추출물을 제조한 후 여러 가지 유기용매로 순차적인 추출을 하여 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 aqueous 분획을 얻었다. 각 분획의 항염증 활성을 측정한 결과, 단감 잎의 chloroform 분획이 가장 높은 활성을 나타내었으며 silica column chromatography, semi-preparative HPLC, recycling preparative HPLC등의 방법을 사용하여 유효활성성분의 분리한 후 LC/MS, NMR 등을 사용하여 그 구조를 분석하였다. 그 결과 1차 silica column chromatography로부터 다양한 생리활성을 가지는 oleanolic acid(OA)를 분리하였으며, 2, 3차 정제를 거쳐 우수한 항염증 활성을 가지는 Fr. 3-11-5과 Fr. 4-14-1을 분리하였다. 그 중에서 Fr. 4-14-1은 다양한 생리활성을 가지는 물질로 잘 알려진 betulinic acid(BA)임을 밝혔다. BA는 LPS가 처리된 RAW 264.7 murine macrophage cell에서 NO의 형성을 효과적으로 억제함(IC50=10㎍/㎖)을 확인하였으며, iNOS, COX-2, TNF-?, IL-1?의 발현 정도를 확인한 결과, 농도가 높아질수록 대조군에 비하여 발현을 억제함을 볼 수 있었다. 이상의 결과로 단감 잎 추출물은 염증의 유발을 억제하여 동맥경화의 예방에 도움을 줄 수 있는 소재로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Sweet persimmon (Diospyros kaki ) is a popular fruit in East As ia, such as Korea, Japan and China. Persimmon’s leaf has been used as a traditional medicine to prevent atherosclerosis. Since atherosclerosis is closely related with inflammation in blood vessel, we purified and determined the structure of anti-inflammatory compounds from the extracts of sweet persimmon’s leaf and fruit. The anti-inflammatory activity was determined by reduction of nitric oxide production of LPS-treated RAW 264.7 murine macrophage cell in the presence of the extract. The 90% methanol extracts of sweet persimmon’s fruit and leaf powder were fractionated with hexane, chloroform, ethyl acetate, and butanol in series , and aqueous fraction remained. As result of cell experiment, chloroform extract of sweet persimmon’s leaf showed the highest anti- inflammatory activity. We purified bioactive compounds by using silica column chromatography, semi-preparative HPLC, and recycling preparative HPLC and analyzed the structure by using LC/MS and NMR. As a result, we separated oleanolic acid(OA) that is a well-known bioactive compounds having anti-inflammatory activity from the initial silica column chromatography. After further purification, we separated Fr. 3-11-5 and Fr. 4-14-1 having excellent anti-inflammatory activities. Between them Fr. 4-14-1 was identified as betulinic acid(BA), a well-known bioactive compound having varius bioact ivities. Nitricoxide production was inhibited significantly in LPSt reated RAW 264.7 mur ine macrophage cell by BA(IC_(50)=10㎍/㎖) and expression of iNOS, COX-2, TNF-a, IL-1b was inhibited dose-dependently when compared with control. These results show that extract of sweet persimmon’s leaf may have a potential as an anti-inflammatory agent .

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 3
• A. 재료 = 3
• B. 감 잎과 감 과육의 추출 및 계통분획 = 3
• 1. 감 잎과 감 과육의 90%methanol 추출 = 3
• 2. 계통분획 = 3
• C. In vitro experiment = 4
• 1. 세포배양 및 = 처리4
• 2. 세포생존율 = 4
• 3. Nitric oxide(NO) 측정 = 7
• 4. Western blot (Immunoblotting) analysis = 7
• D. 분리 및 정제 = 8
• 1. Silica column chromatography를 이용한 1차 정제 = 8
• 2. Silica column chromatography를 이용한 2차 정제 = 8
• 3. HPLC 분석 = 10
• E. 구조분석 = 11
• 1. NMR = 11
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 12
• A. 감 잎과 감 과육의 용매별 계통분획과 In vitro experiment = 12
• 1. 용매분획별 수율 = 12
• 2. In vitro experiment = 14
• B. 감 잎으로부터 항염증 활성 물질의 정제 = 20
• 1. Silica column chromatography를 이용한 1차 정제 = 20
• 2. Silica column chromatography를 이용한 2차 정제 = 20
• 3. HPLC 분석 = 20
• C. 감 잎의 생리활성 성분의 구조분석 = 39
• 1. NMR = 39
• D. Betulinic acid(BA)의 iNOS, COX-2, Pro-inflammatory cyokine에 대한 효과 = 39
• 1. Betulinic acid의 iNOS, COX-2 생성 저해효과 = 50
• 2. Betulinic acid의 pro-inflammatory cytokine 생성 억제 효과 = 50
• Ⅳ. 결론 = 52
• Ⅴ. 참고문헌 = 53