칼로리 제한식이가 췌장 부분 절제 당뇨쥐의 심장에 미치는 영향 = (The) effects of a calorie-restricted diet on the heart of subtotally pancreatectomized diabetic rats

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Purpose) Calorie-restriction diet is strongly recommended to the patients with type 2 diabetes mellitus in current clinical settings to achieve euglycemia, since higher rate of vascular complications was observed as blood glucose level increases. However, a recent clinical trial showed that the morality rate related with cardiovascular disease is higher in intensive glucose control group compared with standard control group, although the level of blood glucose was closer to euglycemia in intensive glucose control group. These findings suggest that the current strategy for the treatment of diabetes targeting to achieve euglycemia even by applying calorie-restriction may not be necessarily beneficial to reduce diabetes related morbidity and mortality, especially in case of cardiovascular complications. Therefore, we hypothesized that achieving euglycemia in insulin deficiency by calorie-restriction may do harm to the heart, where glucose uptake is insulin-dependent, due to energy deficiency compared to hyperglycemic condition. In the present study, we aimed to investigate if calorie-restriction to achieve euglycemia is valid in diabetic rats in terms of cardiac tissue damage and energy metabolism
Methods) Thirteen weeks-old Sprague-Dawley rats were divided into two groups: subtotally pancreatectomized diabetic rats (Px; n=13) and sham operation control rats (C; n=6). Diabetes was induced by 5-weeks ad libitum diet in Px group. Px group was further divided into normal chow diet ad libitum group (AL group, n=6) or a calorie restriction diet group (R group, n=6) and fed for further 6-weeks. The amount of restricted calorie in R group was determined based on the diet consumption in C group so that R group might have the same calorie intake per body weight as C group. Body weight and fasting blood glucose level were measured weekly and biweekly, respectively. After 11-weeks of total experiment period, rats were euthanized with CO2 gas and the blood samples were obtained to measure plasma C-peptide and insulin levels. The heart was taken out and its weight was measured. Cardiac fibrosis, autophagy, and the changes in mitochondrial morphology in heart tissues were evaluated by using light and electron microscopy. The levels of protein expression and activation related to Akt, autophagy, and their upstream regulators regarding cardiac muscle energy and nutrient sensing were also assessed by western blot to elucidate the underlying mechanisms for the changes in heart tissue.
Results) At 23-weeks of age, the concentration of C-peptide and insulin of Px group were 11% (P < 0.001) and 5% (P < 0.001) of C group, respectively. The average blood glucose level of Px group after 5-weeks of ad libitum diet was 541.8 ± 87.9 mg/dl, which was significantly higher than that of C group (114.2 ± 5.5 mg/dl, P < 0.001), confirming the development of overt diabetes. Fasting blood glucose level decreased in R group after the calorie-restriction diet for 6-weeks to the comparable level as that of C group (116.0 ± 12.6 mg/dl vs. 119.8 ± 18.6 mg/dl, P = 0.684). However, the mean body weight of R group decreased to 54.1% of C group (P < 0.001). The heart weight of R group (0.9 g) was lower than that of C or even AL group (1.7 g or 1.3g, respectively; P < 0.001 or P = 0.003, respectively). Light microscopic findings demonstrated that cardiac fibrosis increased in R group compared with C and AL groups. Electron microscopic findings showed a decrease in the density of myocardial fibers, loss of mitochondria, a decrease in the compactness of cristae, and an increase in autophagy in R group compared to C or AL group. The level of phosphorylation of the key insulin signaling for anabolism, Akt, decreased in R group compared to C or AL group (P = 0.001 and P = 0.008, respectively). The phosphorylation levels of Akt in C and AL groups were similar. The autophagy level determined by LC3 II/I ratio increased significantly in R group among all experimental groups (P < 0.001). To elucidate the molecular mechanism underlying the induction of autophagy, the phosphorylation levels of AMPK and mTOR were subsequently determined, in which the phosphorylation level of AMPK increased in R group compared with the other groups and that of mTOR decreased in R group. To investigate whether the reduction of compactness of cristae in mitochondria observed by electron microscopy was associated with a decrease in electron transport chain complexes, the expression level of complex I was measured with western blot, in which the level was lowest in R group among all experimental groups.
Conclusion) Although the subtotally pancreatectomized diabetic rats (R group) achieved euglycemia through calorie restriction compared to the intake of the AL group, R group lost significantly their body weight and heart weight compared to both C and AL groups. Reduced heart weight in R group was attributed to the excessively increased autophagy in cardiomyocytes via AMPK activation and mTOR inactivation under decreased Akt activity, suggesting that even the same calorie intake per body weight in R group as C group may deplete energy level and decrease protein synthesis signal in cardiomyocytes compared to hyperglycemic AL group in insulin deficiency. Additionally, the heart tissue of R group showed increased fibrosis, reduced density of cardiac muscle fibers, alterations in mitochondrial morphology, and decreased mitochondrial complex I expression, suggesting the existence of cardiac damage in the heart tissue of R group. Therefore, these results indicate that a calorie restriction diet to achieve euglycemia in insulin deficiency may be more dangerous than ad libitum diet resulting in hyperglycemia, because a significant loss of functional volume of heart tissue and subsequent cardiac dysfunction can be developed.

국문 초록 (Abstract)

목적) 당뇨병 때 혈당이 높을수록 혈관합병증이 많이 발생하기 때문에 고혈당을 정상화하기 위하여 그 동안 임상에서는 제2형 당뇨병 환자에게 칼로리 제한식이를 강력하게 권장해 왔다. 그러나 최근에 발표되었던 당뇨병 환자 대상 연구에서 일반적 혈당 조절군에 비해 혈당 정상화가 이루어졌던 적극적 혈당 조절군에서 오히려 심혈관 질환으로 인한 사망률이 더 높았다고 보고된 이후, 당뇨병 환자에서 정상 혈당 유지의 당위성에 대해 논란이 일기 시작했다. 이에 본 연구에서는 당뇨쥐에서 정상혈당에 도달하도록 칼로리 제한식이를 실시한 후 자유식이로 고혈당이 된 당뇨쥐에 비해 심장에 유해한 변화가 발생하는지의 여부와 또 허위수술 대조군 쥐 심장에 비해 두 당뇨쥐 군에서 어떠한 변화가 발생하는지 알아봄으로써 당뇨병 환자에서 권장되고 있는 혈당 정상화를 위한 칼로리 제한식이요법의 타당성에 대해 재고해 보고자 하였다.
방법) Sprague-Dawley 계통의 13주령 수컷 쥐를 췌장 부분절제 당뇨병군(Px; n = 13)과 허위수술 대조군 (C; n = 6)으로 나눈 후 자유식이 5주를 시행하여 Px군 쥐에서 당뇨병을 유발시켰다. 그 후 Px군을 다시 자유식이군(AL; n = 7)과 칼로리 제한식이군(R; n = 6)으로 나눈 다음 6주간 더 사육하였다: 이 기간 동안 C군과 AL군은 자유 식이하였고 R군은 C군의 하루 식이량과 같은 량이 공급되게 체중 대비 계산하여 사료를 공급하였다. 사육 기간 동안 체중은 매주, 공복 혈당은 매 2 주마다 측정하였다. 총 사육기간 11주가 지난 후 CO2 흡입에 의해 실험 쥐를 가사 상태에 이르게 한 다음 혈액을 채취하였고 심장을 적출하여 그 무게를 측정하였다. 혈액에서 C-peptide와 혈장 인슐린 농도를 측정하였고 심장 조직의 섬유화, 자가포식현상, 및 미토콘드리아 모양을 각각 광학현미경과 전자현미경으로 관찰하였다. Akt 활성화 정도 및 자가포식현상 정도와 그 상위 조절인자들의 세포 내 신호전달 체계를 확인하기 위하여 심장 조직을 취하여 western blot을 시행하였다.
결과) 사육을 종료한 시점인 23주령 때 검사한 Px군의 C-peptide 및 인슐린 농도는 각각 C군의 11%(P < 0.001)와 5%(P < 0.001)에 해당하는 값을 보였다. Px군의 자유식이 5주 종료 후 평균 혈당은 541.8 ± 87.9 mg/dl로 당뇨병이 확실히 유발되었으며 C군의 혈당인 114.2 ± 5.5 mg/dl보다 통계적으로 유의하게 증가하였다(P < 0.001). 6주간의 제한식이 기간을 거친 후 R군의 혈당은 C군과 통계적으로 차이가 없을 정도로 정상화되었으나(116.0 ± 12.6 mg/dl vs. 119.8 ± 18.6 mg/dl, P = 0.684) R군의 체중은 C군 체중의 54.1% 밖에 나가지 않았다(P < 0.001). R군 심장의 무게(0.9 g)가 C군(1.7 g)에 비하여 가벼웠으며 AL군(1.3g)과 비교하여도 가벼웠다(각각 P < 0.001 및 P = 0.003). R군의 심장 조직에서 C군과 AL군에 비하여 광학현미경상 섬유화가 증가하였고, 전자현미경상 심장 근섬유 밀도 소실과 미토콘드리아 소실 및 크리스타 선명도 감소 그리고 자가포식현상 증가가 관찰되었다. 동화적 대사 관련 주요 인슐린 신호인 Akt의 인산화는 C군과 AL군 사이에 차이가 없었으나 R군에서는 나머지 두 군에 비해 유의하게 감소하였다(각각 P = 0.001 및 P = 0.008). 자가포식현상의 정도를 의미하는 LC3 II/I 비는 R군에서만 유의하게 증가하였다(P < 0.001). 자가포식현상을 유도한 분자적 기전을 알아보기 위해 AMPK과 mTOR 인산화를 조사한 바, AMPK의 인산화는 R군에서 나머지 두 군에 비해 유의하게 증가하였고 mTOR의 인산화는 나머지 두 군에 비해 R군에서 억제되어 두 상위 신호 전달체계에 의하여 R군에서 자가포식현상이 활성화 되었음을 알 수 있었고 이는 각 군의 Akt 인산화 정도와도 잘 연계되었다. 전자현미경상 관찰되었던 미토콘드리아 내 크리스타 선명도 감소가 전자전달계의 주요 기능 단백질 감소와 동반되었는지 보기 위하여 전자전달계 complex I의 발현량을 western blot으로 측정한 결과 R군 값이 C군이나 AL군보다 감소하여 칼로리 제한식이가 미토콘드리아의 중요한 기능적 단백질의 발현을 억제하였다는 것을 확인하였다.
결론) 췌장 부분절제를 통해 당뇨병을 유발시킨 쥐에게 허위수술 대조군 쥐가 섭취한 체중대비 동량의 칼로리를 제공하는 제한식이를 통해 당뇨쥐의 혈당을 정상 수치에 가깝게 떨어뜨릴 수 있었지만, 동화작용의 주체인 인슐린이 결핍된 상태에서 칼로리 제한식이요법을 계속한 이 정상 혈당 당뇨쥐는 허위수술군 뿐 아니라 자유 식이 고혈당 당뇨쥐에 비해서도 체중이 지속적으로 감소되고 주요 장기인 심장의 무게 또한 감소되었다. 정상혈당 당뇨쥐에서 심장무게가 감소된 분자적 기전으로 자가포식현상의 유의한 증가가 관찰되었으며, 이 외에도 고혈당 당뇨쥐 심장에 비해 정상혈당 당뇨쥐에서 유의하게 심장 근섬유 밀도 감소 및 섬유화 증가, 그리고 미토콘드리아 모양 변화 및 전자전달계 complex I 양이 감소되었기 때문에 이로 인한 심장 기능부전 발생 가능성이 예상되었다. 따라서, 인슐린의 보충 없이 칼로리 제한식이를 통해 정상혈당을 유도하는 식이요법은 고혈당을 초래하는 자유식이보다 오히려 당뇨병 환자의 심근을 더 많이 파괴함으로써 심장 기능부전을 초래할 수 있을 것으로 사료되었다.

목차 (Table of Contents)

• 1.서론 1
• 2.실험재료 및 방법 6
• 2.1.실험재료 6
• 2.2.실험방법 8
• 2.2.1.실험동물의 사육 8
• 2.2.2.체중 및 공복 혈당 측정 10
• 2.2.3.췌장 부분절제 수술 11
• 2.2.4.혈액 및 장기 채취 12
• 2.2.5.혈장 C-peptide와 인슐린 방사면역측정법 12
• 2.2.6.혈액 생화학 검사 14
• 2.2.7.심장 조직의 광학현미경 검사 14
• 2.2.8.심장 조직의 전자현미경 검사 15
• 2.2.9.심장 조직의 western blot analysis 15
• 2.2.10.통계 분석 16
• 3.결과 17
• 3.1.혈장 C-peptide와 인슐린 농도 17
• 3.2.사료 섭취량 및 체중 대비 일일 섭취량 변화 18
• 3.3.체중 변화 19
• 3.4.혈당 변화 21
• 3.5.심장 무게 23
• 3.6.혈액 생화학 분석 24
• 3.7.심장 조직의 광학현미경 소견 25
• 3.8.심장 조직의 전자현미경 소견 28
• 3.9.심장 조직의 western blot analysis 30
• 4.고찰 35
• 참고문헌 51
• 국문초록 59