단일염기다형성 검사를 위한 PCR-RFLP법과 Real-Time PCR법의 유용성 비교 = Comparison of PCR-RFLP and Real-Time PCR for allelotyping of Single Nucleotide Polymorphisms

국문 초록 (Abstract)

단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)은 인간의 유전자 서열 1000염기에 1개 빈도로 발견되어 인간은 대략 300만개의 유전자 다형성을 가지고 있다. 이 유전자 다형성은 보통 전체 인구의 1% 이상에서 발견되는데 다양한 다형성의 조합결과로 인간의 개체 간 특성들이 결정되는 것으로 이해되고 있다. 이러한 다형성들의 조합양상에 따라 특이 질환에 대한 유전자 감수성 또한 달라지게 되므로 최근에는 많은 질환들과 유전자 다형성들과의 상관관계를 보는 연구들도 활발하게 진행되고 있다. 이러한 SNP분석은 큰 집단을 대상으로 진행되어 지므로 적은 비용으로 정확하게 그리고 대용량으로 분석할 수 있는 방법이 필요하다.
본 연구에서는 promotor상에 위치한 -37과 -524 염기부위에서 유전자 다형성을 보이는 것으로 보고되어져 있는 RRM1(ribonucleotide reductase M1)유전자를 대상으로 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)와 real-time PCR(TaqMan probe assay)을 동시에 시행한 후 각각의 결과를 비교 분석하여 유전자 다형성을 보다 빠르고 정확하게 검사할 수 있는 방법을 모색해 보았다.
먼저, 대상 환자 89명의 genomic DNA를 가지고서 RRM1 유전자의 SNP에 대한 PCR을 수행하고 이 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리(PCR-RFLP)하여 유전자 다형성 양상조합을 확인하였다. 그다음 PCR-RFLP방법으로 확인한 동일대상 DNA로 real-time PCR을 시행한 후 유전자 다형성 조합을 확인, PCR-RFLP 결과와 비교 분석하여 보았다. 결과, 대상 DNA 89례중 -37에서는 2례(2.17%), -524에서는 15례(16.26%)가 서로 다른 양상을 보였다. 결과차이를 보인 샘플 17례를 대상으로 직접 염기서열 분석을 시행하여 본 결과, 17례 모두 real-time PCR에서 확인되었던 결과와 일치함(100%)을 확인할 수 있었다.
추가 샘플 138례를 대상으로 real-time PCR을 2회 연속 실행하여 genotyping을 해 본 결과 98%이상의 높은 일치율을 보였으며, 그중 10례를 무작위로 골라 직접 염기서열 분석을 시행하여 본 결과, 역시 100%일치, 높은 정확도를 보였다. 또한 in-tube assay 방식으로 샘플의 오염을 최소화 할 수 있었으며 72well based system(Corbett Research)을 이용함으로 1회 유전자 증폭반응을 통해 72개 샘플결과를 한번에 확인할 수 있었다.
결론적으로 큰 집단을 대상으로 다량의 SNP를 분석하기 위한 실험 방법으로는 real-time PCR이 신속하면서도 정확한 결과를 얻을 수 있는 방법으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• 국문 초록 1
• 서 론 3
• 연구 대상 및 방법 5
• 결 과 9
• 고 안 13
• 결 론 17
• 참고 문헌 30
• 영문 초록 34