치주질환 예방과 치료를 위한 식물항체 개발, 2015 = Development of plantibody for periodontal disease R&D Report(2015)

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Purpose&Contents : To develop a transgenic plant which expresses antibody specific for P. gingivalis, cDNA encoding monoclonal antibodies to 53-kDa protein (a major protein of minor fimbriae; Mfa1) of P. gingivalis A7A1-28 was cloned from hybridoma cell lines expressing the monoclonal antibodies (mAbs). The heavy and light chain genes were constructed into plant expression vectors under the control of the rice α-amylase 3D promoter. The plant mAbs (plantibodies) were produced by rice cell suspension cultures of the transgenic rice calli transformed with the recombinant plant expression vectors.
Results
1. A transgenic plant expressing antibody specific for P. gingivalis was generated, and its plantibody demonstrated to be equally biologically active as the mouse parental mAbs (Plant Cell Tiss Organ Cult.126:387-397, 2016; published).
2. Plantibody against a major structural protein (FimA) of P. gingivalis fused with cholera toxin B subunit (CTB) was produced by rice cell suspension cultures and shown to be as effective as the mouse parental mAb in inhibiting the bacterial invasion and increasing phagocytosis and bacterial clearance from the animal body (Clin Vaccine Immunol. 23:346-352, 2016, published; A patent application pending.
3. Three DNA fragments of the gene encoding 53-kDa protein were fused with ctb gene and used to transform tobacco leaves by agrofiltration. Antisera from mice immunized with CTB-Mfa1(1/3 N-terminus) were found to be significantly reactive with Mfa1.
4. The gene encoding the full-length 53-kDa protein was expressed in tobacco.
5. Genomic variations of 5 strains of Prevotella intermedia were deciphered by whole genome sequencing data comparison, annotation, pan-genome analysis, CRISPR -Cas system analysis and single nucleotide polymorphism (SNP) analysis.
6. Antibacterial effect of polyphosphate on Porphyromonas spp. frequently found in the oral cavity of pets were examined by MIC and MBC determination, time-kill assays using planktonic and biofilm sessile cells of Porphyromonas spp., and changes in their ultrastructure under SEM and transcriptome.
Expected Contribution : Use of plantibody for prevention and blocking progression of periodontitis Strategic fundamental technology for active and passive vaccines Use of plantibody for prevention and blocking progression of pet periodontitis Improvement of systemic body health through prevention of periodontitis Reduced personal and national burden caused by oral and systemic diseases Transgenic plants producing antibodies themselves are high value-added items Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals Opportunities provided for interdisciplinary research projects

국문 초록 (Abstract)

연구의 목적 및 내용 : 치주질환은 성인에서 치아상실의 가장 중요한 원인으로서 세균감염질환. Porphyromonas gingivalis는 치주질환의 가장 중요한 원인균. 본 연구의 최종목표는 P. gingivalis를 억제할 수 있는 특이항체를 발현하는 형질전환식물을 개발하여 식물항체(plantibody)를 생산하는 것. 이를 위해 P. gingivalis의 6개 genotype 중에서 치주질환 환자에 가장 많이 나타나고 고병원성인 genotype II에 속하는 A7A1-28균주에서 강한 면역성을 가진 53 kDa 단백질(75 kDa 단백질과 다른 또 하나의 minor fimbriae [variant Mfa1]를 구성하는 주 structural subunit protein) 항원을 표적으로 이에 대한 단클론항체를 생산하는 B cell clone을 생산. B cell clone의 RNA를 PCR하여 얻은 cDNA로부터 heavy, light chain 유전자를 확보한 후 이를 벼 amylase 3D promoter가 있는 pMYV111 식물발현벡터에 클로닝. 이 재조합식물벡터로 벼 embryonic callus를 particle bombardment방법으로 형질전환하여 얻은 벼 callus를 rice cell suspension culture로 식물항체 생산
연구개발성과
1. P.gingivalis A7A1-28 균주의 53 kDa 단백질 항원에 대한 항체유전자로 형질전환시킨 벼 callus를 rice cell suspension culture로 식물항체 생산하는 기법 확립하였고, 생산된 식물항체가 53 kDa 단백질과 반응하는 생물학적 활성이 있음을 확인(연구과제: Plant Cell Tiss Organ Cult. 126:387-397, 2016 발표)
2. FimA에 대한 항체를 rice cell suspension으로 생산한 후 정제한 IgG 식물항체가 마우스 parental 단클론항체와 같은 생물학적 활성도를 발휘될 수 있음을 관찰(Clin Vaccine Immunol. 23:346-352, 2016 발표; 현재 특허출원 중)
3. 53 kDa 단백질의 유전자를 3개로 나누어 cholera toxin B subunit의 유전자와 융합시킨 CTB-Mfa1-1(51-200 아미노산 서열; mature protein은 51번부터), CTB-Mfa1-2 (201-350) 그리고 CTB-Mfa1-3 (351-498) 유전자를 agrofiltration하여 얻은 담뱃잎 형질전환체를 마우스에 경구투여한 결과, CTB-Mfa1-1면역 마우스의 항혈청과 분변추출물이 Mfa1 항원에 대해 유의하게 높은 면역반응을 보임
4. full-length mature 53 kDa protein의 유전자를 식물발현벡터에 클로닝한 후 agrofiltration으로 담뱃잎에 53 kDa 단백질 발현 유도
5. major fimbriae의 주 구성물질인 fimbrillin (FimA)의 유전자(266-337 아미노산서열)와 CTB를 융합시킨 CTB-FimA(266-337) 유전자를 식물발현벡터에 클로닝한 후 agrofiltration하여 담뱃잎에 융합단백질을 발현시킨 형질전환체 확보
6. Prevotella intermedia 균주간의 변이를 관찰하기 위해 5개 균주의 wholegenome sequencing data comparison, annotation, pan-genome analysis, CRISPR-Cas system analysis, Single Nucleotide Polymorphism (SNP) analysis 시행
7. 반려동물의 치주질환에 관여하는 Porphyromonas 종에 대한 polyphosphate (polyP)의 항균력 평가를 위해 이들 세균의 planktonic, biofilm cell에 대한 polyP 억제효과, 세균세포의 전자현미경적 변화, transcriptome의 변화를 관찰
연구개발성과의 활용계획(기대효과) : 식물항체는 치주질환의 예방, 진행의 억제 및 치료에 사용. 한편 치주질환이 중요 소인으로 작용하는 것으로 알려진 심혈관질환, 뇌졸중, 류마티스성 관절염, 당뇨병, 조산아출산과 같은 전신적인 문제도 치주질환을 억제함으로써 상당부분 예방 또는 호전시킬 수 있기 때문에 의료비로 인한 개인 및 국가의 재정적 부담을 감소시키는 등 경제적 가치가 큰 고부가가치 상품. 식물항체 수동백신 생산기술은 감염예방백신의 기본전략으로 활용 가능하고 다양한 치료·진단용 단백질 생산을 위한 식물형질전환체 기반기술로 활용함으로써 21세기 유망 바이오의약품 분야 선도 가능. 또한 식물분자생물학분야를 치·의학, 수의학분야에 접목함으로써 다양한 학제간 연구가 가능하고 연구대상을 폭넓게 확대할 수 있는 계기마련