분자ㆍ세포생물학적 기법을 활용한 독성 예측시스템 개발 = Novel screening system to predict target organ toxicity on the basis of molecular and cellular mechanisms

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The purpose of this study is to screen the functional and structural damage in three target tissues including cardiovascular system, liver, carcinogenecity. This testing will be very specific and sensitive compared to the conventional testing to detect biomarker alteration. Our screening will be validated through in vivo animal model. So far, significant correlation between in vitro testing system and in vivo animal model was observed. Each project was summarized as follows. The first project is to set up the in vitro screening system to evaluate the cardiovascular toxicity induced by a chemical. Using the aortic rings in organ bath system, functional alterations such as the increased vasoconstriction and the decreased vasorelaxation were observed, which is irreversible. In addition, adhesion molecule expression, PS exposure and microparticle generation in platelets and erythrocytes were nicely correlated with functional damage such as the increased procogulant and attachment to endothelial cells This alternative in vitro system could be useful for the rapid screening of vascular toxic chemical to induce hypertension and thrombosis, respectively. The second project is to develop efficient alternative high throughput hepatotoxicity screening method to improve the current high-cost, low-efficiency test system. By coupling the cDNA microarray hybridization method and conventional toxicity testing methods we categorized several groups of the genes that have been changed in response to representative hepatotoxic substances, such as acetaminophen, carbon tetrachloride, phenobarbital and a-naphtylisothiocyanate. We developed cell-based assay system using phosphatidylglycerol synthase overexpression and knockout cell line and confirmed the efficiency with acetaminophen. In the third project, we established stable reporter cell lines that express luciferase upon transcriptional activation of HIF-1, p53, Nur 77, and COX-2, of which roles are well characterized during cancer development. These reporter cell lines displayed low constitutive background luminescence, however, it was significantly enhanced in response to CoCl2/DFO, adriamycin, PMA/ionomycin in a time- and dose-dependent manner. Known tumor promoters, such as TPA, induced luminescence at low concentration (10 nM) in these reporter cell lines. These results indicate that our stable reporter cell lines are useful cell models for rapid assessment of carcinogenicity of toxic chemicals.

국문 초록 (Abstract)

본 연구개발의 특징은 기존의 biomarker 변화를 스크리닝하는 것이 아니라, 심혈관독성, 간독성, 발암성과 직접 관련된 functional & structural damage (기능 및 구조 손상)을 스트리닝하는 독창적 기술임. 본 기술개발은 in vivo 독성시험과의 상관성 검증을 통하여 현재의 고비용, 저효율 in vivo 독성시험을 대체 가능한 신기술으로써 현재까지 시험관시험 및 in vivo 예비시험을 통하여 주목할 만한 다음과 같은 성과를 얻었다. 제1세부과제에서는 심혈관 질환을 일으키는 혈압 증가 및 혈전생성과 관련된 기능을 토대로 한 독성평가 in vitro 시험계를 구축하였다. 즉 화학물질은 혈관을 적출한 organ bath에서 수축이완에 기능상의 손상을 일으킴을 확인하였으며, 적혈구, 혈소판의 혈액응고 기능에 손상을 미침을 확인하였으며, 관련된 biomarker의 기전을 연구하였다. 이러한 변화는 동물모델에서 혈압증가 및 혈전을 일으킴을 확인함으로써 화학물질에 의한 심혈관 독성을 예측할 수 있는 신기술로 활용이 가능하다. 제2세부과제에서는 현재 고비용 저효율 과정인 in vivo 독성시험을 대체하거나 상관성이 높은 in vitro 간독성 스크리닝 시스템을 개발하기 위하여 고속검색시트템인 toxicogenomics와 전통적인 독성시험방법을 결합하여 acetaminophen, CCl4, phenobarbital, a-naphtylisothiocyanate 등의 간독성을 평가하였다. custom-made cDNA chip을 이용하여 독성기전별 유도되는 유전자군을 검색하고, 이중 미토콘드리아 에너지대사를 저해하는 phosphatidylglycerol synthase의 고발현세포주와 넉아웃세포주를 이용한 cell-based assay system을 구축하였고 이를 acetaminophen을 이용하여 검증하였다. 제3세부과제에서는 발암의 분자세포생물학적 기전에 근거하여 DNA 손상, 세포 증식, 암 진행, 염증반응 등을 모니터할 수 있는 지표로서 각각 p53, Nur77, Hypoxia inducible factor-1 (HIF-1), Cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현을 측정할 수 있는 리포터 유전자 영구 발현 세포주를 구축하고 다양한 발암성 물질을 이용하여 검증하였다. 본 과제에서 확립한 발암성 예측세포주는 신규 및 기존 화학물질의 발암성을 검색하고 발암물질을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있으며 차세대 발암성 in vitro 독성 평가에 광범위하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.○ 연구목표 : 화학물질 노출로 인한 인체내 가장 주요한 target 인 심혈관, 간, 발암성을 대상으로 신물질의 독성을 효율적으로 검색할 수 있는 독성예측시스템을 분자‧세포생물학적 기법을 통하여 개발하고자 한다. 본 개발의 특징은 기존의 biomarker 변화를 스크리닝하는 것이 아니라, 심혈관독성, 간독성, 발암성과 직접 관련된 functional & structural damage (기능 및 구조 손상)를 스크리닝하는 독창적인 기술이다. 본 기술은 in vivo 독성시험과의 상관성 검증을 통하여 현재의 고비용, 저효율 in vivo 독성시험 를 대체할 수 있는 신기술을 구축하는 것을 최종 목표로 한다. 이러한 최종목표 하에 세가지 target (심혈관, 간, 발암)에 대하여 다음과 같은 세부 목표를 갖는다.
1) Functional-based 혈관독성 예측시스템
본 연구에서는 혈압증가 및 혈전생성과 관련된 주요한 기능 및 구조상의 변화를 분자‧세포생물학적 기술을 활용하여 예측하는 기술을 개발
2) 독성유전체학을 이용한 간독성 예측시스템
독성유전체학을 이용하여 주요 간 독성물질에 반응하는 유전자를 탐색하고, 연관되는 작용기전을 분석함으로써, 독성 및 안전성검사를 분자수준에서 효율적으로 예측하는 독성예측 모델계를 구축
3) 발암기전에 근거한 발암성 예측 세포주 개발
발암의 분자세포생물학적 기전에 근거하여 DNA 손상, 세포 증식, 암 진행, 염증반응 등을 모니터할 수 있는 지표로서 각각 p53, Nur77, Hypoxia inducible factor-1 (HIF-1), Cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현을 측정할 수 있는 리포터 유전자 영구 발현 세포주를 확립하여 신물질의 발암 검색 대체시험계로 개발
○ 연구내용 : 심혈관 독성과 관련되어 고혈압을 유발할 수 있는 독성예측시스템을 위하여 aortic rings을 organ bath에 걸어 혈관 수축‧이완 기능을 평가하였으며 기능상의 변화와 관련된 biomarker을 검색 하고 in vivo와 상관성을 연구함. 그리고 혈전 (thrombus) 생성 독성예측시스템을 위하여 부착력 기능 (Cell adhesion) 및 혈소판 및 적혈구에 세포막에 phosphatidylserine (PS) 노출을 통한 coagulation cascade 증가 및 microparticle 생성에 의한 형태변화를 검색하고 혈액응고 촉진 기능 (pro-coagulant activity)과의 상관성을 연구함 다양한 종류의 간독성물질에 의해 유도되는 유전자들을 이용한 cDNA chip을 제작하여 APAP, PB, CCl4, ANIT 등의 대표적 간독성물질에 의해 유도되는 유전자를 검색하였다. 이중 세포에서 에너 지대사에 관여하는 유전자 발현을 억제하고 mitochondria에서 ATP 합성을 저해하는 화합물에 대해 미토콘드리아의 막단백질인 cardiolipin을 합성하는 phosphatidyl glycerophosphate synthase (PGS)를 고발현 혹은 발현억제한 세포주를 제작하여 이를 이용한 간독성 스트리닝을 수행함 발암성 모니터링 유전자 영구 발현하는 세포주 (p53, Nur77, HIF-1,와 COX-2 리포터)를 확립하고, 작용 기전 특이 화학물질을 이용한 발암성 예측 세포주의 검증함. 그리고 DNA damaging agents, PMA, Ionomycine, Hypoxia, LPS에 의한 지표 유전자 induction의 농도 및 시간 의존성 확인하고 Transfected cell의 passage에 따른 지표 단백질 induction 활성 변화 확인농도 및 시간 의존성 확인하였음. Tumor initiator와 promoter를 이용한 발암성 예측 세포주의 검증을 위하여 Tumor initiator와 promoter의 작용기전에 따른 지표 단백질 induction 비교, TPA 유도체에 의한 구조-활성관계 (SAR) 연구, Anti-promoter에 의한 지표 유전자 induction 억제 여부를 수행하였으며, 현재 In vivo two-stage carcinogenesis model을 사용한 기존의 결과와 상관성 비교 및 분석중임.
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