당뇨병성 만성 피부상처에 대한 초음파 미세기포파괴술 상피성장인자 유전자치료 = Ultrasound microbubble destruction EGF(Epidermal Growth Factor) gene therapy for chronic diabetic skin ulcer

국문 초록 (Abstract)

I. 연구개발의 목적 및 필요성
당뇨병성 만성 피부궤양은 최근 폭증하고 있는 당뇨병 환자들에서 발생될 수 있는 치명적인 합병증의 하나입니다. 환부의 압력 제거, 항생제의 투여와 변연절제술 등이 현재 시행되고 있는 치료방법들입니다. 최근 EGF와 PDGF 같은 성장인자들을 단백질의 형태로 환부에 도포하는 치료 방법이 개발되어 사용되고는 있지만 고가이고, 최소 하루 한 번 환부에 도포해야 하며, 도포된 단백질이 환부에서 빨리 분해되어 버림으로 해서 효율적인 치료 방법이 아직 되지 못하고 있습니다. 유전자 치료는 특정 단백질의 유전자를 직접 투여하여 환부에서 단백질을 생산함으로써 치료 효과를 얻는 새로운 치료 방법입니다. 한 번의 유전자 투여로 짧게는 수 주에서 길게는 몇 년 동안 목표 조직에서 치료 단백질의 농도를 일정하게 유지할 수 있는 획기적인 기술입니다. 유전자를 치료 목표에 전달하기 위한 기술적인 방법에 따라 바이러스 전달체와 비바이러스 전달체 식으로 구분합니다. 기존의 유전자 전달 방법들은 장단기적인 생물학적 및 화학적 독성때문에 아직까지 실용화가 되지 못하고 있는데, 초음파를 이용한 유전자 전달 방법은 화학적 및 생물학적 독성이 거의 없이 안전한 것으로 알려져 있습니다. 본 과제는 임상에서 실제 사용될 수 있는 당뇨병성 만성 피부궤양의 신속하고 효율적인 치료를 위한 성장인자 초음파 유전자 치료 기술을 개발하기 위해 수행되었습니다.
II. 연구개발의 내용 및 범위
1) 만성 피부상처 치료용 고효율 EGF DNA 및 plasmid cloning
2) 당뇨병 유발 mouse 피부 상처에 대한 EGF 초음파 유전자 치료 실험
3) 당뇨병 유발 rat 피부 상처에 대한 EGF 초음파 유전자 치료 실험
4) Plasmid의 효율을 더 증대시키기 위한 minicircle DNA cloning
III. 연구개발 결과
1) EGF DNA에서 가장 효율이 높은 EGF828의 cloning에 성공하였습니다. EGF828을 포함한 고발현효율의 pBETA-EGF828 plasmid의 cloning에도 성공하였으며, 다양한 세포주들에 대한 실험들을 통해 그 발현효율을 확인하였고, 기존의 EGF와 동일한 신호전달체계를 활성화 시킴을 확인하여 생물학적 효과는 동일함을 증명하였고, 특허 취득을 완료하였습니다.
2) Streptozotocin으로 당뇨병을 유발한 mouse에 초음파 유전자 전달기술을 통한 유전자 치료 실험을 통해 성공적으로 신속한 피부 상처의 치유를 증명하였습니다.
3) Streptozotocin으로 당뇨병을 유발한 후 피부 상처의 회복과정을 정상 rat과 비교해서 지연되어 있음을 확인하였습니다. 이전 mouse에 대해 시행한 실험과 동일한 디자인의 실험을 시행하고 있는 중입니다.
4) pBETA-EGF828의 발현 효율을 더 증대시키기 위해 minicircle DNA 형태로의 cloning도 성공적으로 수행하였으며, 세포주들에 대한 실험들을 통해 minicircle DNA 형태의 EGF828이 더 높은 효율을 나타낼 수 있음을 증명하였습니다.
IV. 연구개발 결과의 활용 계획
본 연구는 초음파를 이용한 피부에의 성장인자 유전자 치료가 실제 동물들에서 효과가 있음을 증명한 세계 최초의 연구입니다. 아울러 기존에 사용되어 오던 EGF의 DNA 중에서 가장 효과가 강력한 EGF828을 내포하고, 세포 외부로의 분비를 활성화 시킬 수 있는 FRM sequence를 가진 치료용 plasmid DNA의 특허 취득에도 성공하였습니다. 기존의 어떠한 유전자 치료들과 비교해서도 독성이 전혀 없으며, 그 치료 효과도 뒤떨어지지 않음을 다양한 동물 실험들을 통해 증명하였기에 실제 임상으로의 진입에 가장 유리할 것으로 예상되는바 현재 전임상 단계로의 진입을 위해 준비를 하고 있습니다. 본 과제를 통해 구축한 유전자 치료 기술은 비단 만성 피부 질환 뿐만 아니라 유전자 치료가 필요한 다양한 질환들의 치료에 응용될 수 있는 원천기술의 속성을 지니고 있습니다. 따라서 만성 난치성 피부 궤양 치료를 위한 바이오 신약으로의 개발 과정을 통해 계속적으로 축적되는 원천 기술들을 활용하여 보다 다양한 질환들의 치료에 응용하기 위한 준비 역시 현재 진행하고 있습니다. 현재까지의 실험 결과들을 우수한 저널들에 계속 발표할 예정이며, 전임상 및 임상시험 단계를 통해 세계적인 임상 논문집에도 투고를 할 계획입니다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Chronic skin ulcers of diabetic patients are very notorious for delayed healing. It will cause limb amputaions, sepsis and even death of the patients. Recently, growth factors such as EGF (Epidermal Growth Factor) and PDGF (Platelet derived Growth Factor) are introduced in the clinical practice. But their costs are so high, and they require daily administration because of the short half life at the wound bed due to the rapid degradation by hostile proteinases overly expressed in the chornic wound bed. Gene therapy can be defined as the introduction of the DNA of the specific protein with therapeutic potential into the tissue, and let it to produce the therapeutic protein at the cells of the target tissue. This strategy could bypass the hostile attack of the non-specific proteinases at the wound surface, and long-standing therapeutic effects via the extended production of therapeutic protein with just one single DNA injection. Unfortunately, gene delivery methods which include viral and non-viral gene carriers have been criticized for their biologic and chemical toxicities, which have limited their usage in the real clinical practices. Ultrasound microbubble destruction gene delivery has been known to be the most safe method for gene therapy. Our project aimed to develop the most safe and effective growth factor gene therapy technique for the fast and efficacious healing of notorious diabetic chronic skin ulcers.
Our project includes the following items;
1) Find out the most effective piece of DNA in EGF, and cloning of this segment into the therapeutic plasmid DNA which could be used in the animal experiment. Also the verification of its biologic competency in the various cultured cell lines.
2) Verify the efficacy and toxicity of cloned therapeutic plasmid delivered by sonoporation into the streptozotocin diabetic mouse model.
3) Verify the effect and safety of therapeutic plasmid delivery via sonoporation into the streptozotocin diabetic Whsitar rat model.
4) Cloning of minicircle DNA which contains only cDNA of EGF828, promoter and polyadenylation tail. Minicircle is the most powerful DNA to be used in the non-viral plasmid gene therapy due to its low toxicity and long-term expression profiles.
We succeeded to clone the most effective segment of EGF DNA "EGF828", and inserted this segment into the pBETA plasmid DNA. We verified its biologic competency via the proof of sound signal transduction in the cultured cell lines. We then added FRM (furin recognition motifl) to enhance the secretion of produced EGF from the cells. We got the patency of this novel plasmid "pBETA-FRM-EGF828". We delivered pBETA-FRM-EGF828 plasmid into the skin wound of streptozotocin diabetic C57BL6 mice via ultrasound meditated microbubble destruction method. Enhanced speedy wound healing and sound microarchitecture of healed wounds were verified by various special stains along with visual inspections. We will soon perform nearly the same experiment using streptozotocin diabetic Whistar rats. We already verified the delayed skin wound healing of strepzotocin diabetic rats. After the in-vivo verification of cloned novel plasmid "pBETA-FRM-EGF828", we performed additional cloning to make minicircle pBETA-FRM-EGF828 which might be the best therapeutic DNA for the use in the non-viral plasmid based gene therapy. We finally succeeded to clone MINI-pBETA-FRM-EGF828 and verified its superior efficacy in the cultured cell lines. Our project was the world first attempt to verify ultrasound mediated growth factor gene therapy for the skin. We accumulated many fundamental techniques for the gene therapy, and which will be used in the development of gene therapy techniques for the other diseases. With the proved superior safety and comprehensible efficacy of this method, we are now preparing to enter the "pre-clinical trial". We will publish our results in the world renowned peer reviewed journals