영장류 프로모터(non-human primate promoter) 기반 역유전학법 (Reverse Genetics)을 응용한 재조합 신종인플루엔자 바이러스 제작기법 확립 = Establishment of recombinant novel influenza virus using reverse genetic system containing non-human primate promoter

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

￭ Screening of novel promoter-site derived from Vero cell line to develop a reverse genetics system based on non-human primate promoter.
- To screen the promoter of a monkey kidney, non-human primate (Vero) cell line, we confirmed the sequence of the polymerase I promoter using a 2,800bp region which is homologous to the human IGS region that contains the promoter site.
- Based on the results of sequence analysis, we confirmed that there is an 86% homology of nucleotide sequences between IGS site of Vero cell and human IGS + 18S site registered in GenBank; the Vero promoter varies in four nucleotide positions on the 8 critical sites of the transcription initiation site of the human polymerase I.
￭ Reconstruction of a new pHW2000 vector (pHW-Vero-Pol I) with substituted Pol I promoter (from human-to-Vero) by restriction enzyme digestion.
- We reconstructed Vero PolI promoter-based pHW2000 vector by substituting the human PolI promoter region with the Vero PolI promoter region, which size is about 300-400bp (PolI promoter + enhancing regions), by using specific restriction enzyme digestion sites.
￭ Efficiency tests of newly reconstructed vector.
- Reverse genetics viruses using 7 clones from previous system and 1 clone from new system of A/PR/8/34 virus were successfully rescued in both 293T and Vero cells.
- Based on the results of the mini-genome polymerase activity using luciferase assay, we confirmed that the new system using Vero PolI promoter increased the amount of luciferase activity approximately 5-7 times more than the previous system which utilized human polI promoter.

국문 초록 (Abstract)

￭ 영장류 프로모터 기반, 역유전학법 기술개발을 위한 vero cell 유래의 프로모터 유전자 검색
- Vero cell의 ribosomal RNA를 transcription 하는 Vero cell기원의 promotor부분을 screening 하기 위하여, Vero cell genomic DNA를 순수 분리한 후 polymerase I promotor 부위를 포함하는 약 2,800bp의 DNA를 sequence 하였음.
- 유전자 비교 분석결과 NCBI의 GenBank에 등록된 human IGS + 18S 부위의 sequence와 이번 연구에서 새롭게 밝혀진 Vero cell 기원의 promoter 염기서열 부위가 86%의 유사성이 있음을 확인하였으며, 특히 human polymerase I 이 전사를 시작하는 부위의 유전자 8개 중 4곳의 nucleotide가 다른 것으로 나타났음.
￭ 기존 벡터 (pHW2000)에 존재하는 human PolI promoter 부위를 제한효소 처리를 통해 제거하고 Vero 세포유래의 polI 프로모터 예상부위로 치환된 Vector의 제작
- Human PolI promoter를 기반으로 하는 벡터 (pHW2000)내의 다양한 Restriction enzyme site를 활용하여 human PolI promoter I 부위를 제거한 후, Vero PolI promoter를 포함하는 약 400bp (PolI promoter + enhancing regions)부위의 유전자로 치환하여, Vero PolI promoter 기반 vector system (pHW-vero-polI plasmid)을 확립하였음.
￭ 새롭게 만들어진 vector의 효능검증
- A/PR/8/34 바이러스 유전자 8개를 새롭게 개발한 pHW-vero-polI plasmid에 cloning하였으며, 이를 각각의 유전자를 가진 재조합바이러스 (7+1조합)를 Vero cell에서 rescue 하는데 성공하였음.
- Luciferase를 이용한 polymerase activity 결과, Vero PolI promoter의 vector system이 기존의 human polI promoter system 보다 약 5-7배 정도 높게 polymerase activity가 증가하는 것을 확인하였음.