역유전학방법에 의한 저병원성 조류인플루엔자 재조합바이러스의 확보 및 면역학적 특성분석, 2007 = Construction of low pathogenic influenza viruses using reverse genrtic methods and evaluate their immunogeicity

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objectives : We have been carrying out the research projects regarding avian influenza virus isolation and genetic characterization from wild migratory birds and domestic poultry with many collaborating institutes. Therefore, the main objects of this research project are first, screening the viruses which have any potential threat to human infections among our isolates; second, obtaining the selected clones of isolates, and then producing the recombinant avian influenza viruses by reverse genetic method.
Methods :
 RNA extraction from the H1, H2, H3, H5, H7, H9, N1, N2, and N7 subtypes of avian influenza viruses, RT reaction for cDNA and then cloning into RNA Pol1- driven vector.
 In case of HPAI, removal of connecting peptide on HA segment to produce the high viral titer strains in embryonated eggs.
 Establish the standard procedures for infectious recombinant virus rescue by 8 plasmid co-transfection into cells.
 Rescue the recombinant viruses of H1, H2, H3, H5, H7, H9, N1, N2, and N7 subtypes of avian influenza viruses containing 6 internal genes of PR/8/34 virus.
 Determine the viral titer of the rescued virus by HI, CPE and PFU assays.
Results
 We set up the reverse genetic methods for avian influenza virus rescue and standardized the protocol for recombinant viruses using A/PR/8/34 virus.
 We successively selected H1, H2, H3, H5, H7, and H9 subtypes from our previous virus isolates and cloned into pHW2000 vector.
 We successively selected N1, N2, and N7 subtypes from our previous virus isolates and cloned into pHW2000 vector.
 We produced the H1N1, H1N2, H1N7, H3N2, H5N1, H5N2, H5N7, H7N1, H7N2, and H7N7subtypes of recombinant viruses containing the 6 internal genes of A/PR/8/34 vaccine parental virus.

국문 초록 (Abstract)

목표: 본 연구실은 국내에서 발생 가능한 조류 인플루엔자 바이러스들의 screening을 위해 지속적인 가금 및 야생 조류로부터 조류 인플루엔자바이러스의 분리를 해 다수의 조류 인플루엔자바이러스의 대한 유전자를 확보하기 위해 여러 기관과 협력으로 연구를 수행 중에 있음. 이들국내 분리 조류 인플루엔자 바이러스 중 인체감염이 가능할 것으로 추정되는 조류인플루엔자를 선별하여, 역유전자 방법으로 선별된 바이러를 이용하여 저병원성의 조류인플루엔자 재조합 바이러스 clone을 확보하여 재조합바이러스를 생산하는 방법을 확립하고자 하였음.
세부 연구방법
􀁺 H1, H2, H3, H5, H7, H9 및 N1, N2, N7의 혈청형을 가진 조류인플루엔자로부터 RNA의 추출 및 reverse transcription에 의한 cDNA의 확보 및 RNA Pol1- driven vector에의 cloning
􀁺 HA 절단부위를 포함한 바이러스 단백질 coding region에 변이를 도입한 수정란에서의 유전적 변형고생장 백신균주 확보
􀁺 8개의 plasmid DNA의 total transfection에의한 재조합 바이러스 rescue의 최적화 조건을 확립함.
􀁺 공여바이러스 (A/PR/8/34) internal gene cDNA와 H1, H2, H3, H5, H7, H9 및 N1, N2, N7 virus의 HA 및 NA cDNA의 total transfection에 의한 infectious 재조합 바이러스 백신주를 rescue함.
􀁺 상기 바이러스의 세포배양 및 수정란에서의 titer를 HI assay, cytotoxic effect 및 pfu 등의 인자로 결정함.
연구의 진척도
􀁺 1차년도 추진 계획이었던 reverse genetic system을 이용한 재조합 바이러스 방법의 확립 및 이를 이용한 재조합 바이러스 생산방법을 표준화 하였음.
􀁺 기존의 본 연구실의 기 분리된 조류 인플루엔자 바이러스들 중에서 1차년도의 연구계획이었던 조류인플루엔자의 인체 예비 백신 균주 생산을 위한 H1, H2, H3, H5, H7, H9 hemaglutination (HA)유전자 국내 야생조류에서 분리한 바이러스로부터 확보하였음.
􀁺 기존의 본 연구실의 기 분리된 조류 인플루엔자 바이러스들 중에서 1차년도의 연구계획이었던 조류인플루엔자의 인체 예비 백신 균주 생산을 위한 N1, N2, N7의 Neuramidase (NA)유전자와 이외의 N2 및 N9의 유전자를 국내 야생조류에서 분리한 바이러스로부터 확보하였음.
􀁺 상기 확보된 HA 그리고 NA유전자와 PR8공여바이러스의 내부 유전자를 이용, 역유전자 방법을 이용하여 H1N1, H1N2, H1N7, H3N2, H5N1, H5N2, H5N7, H7N1, H7N2, 및 H7N7subtypes의 재조합 바이러스를 1개씩 생산하였음.
* 2차년도과제와 연계하여 항원성 분석실험을 수행하고자함.