형질전환 생쥐들에 있어서 혈관신생에 의한 Mena/VASP 단백질 및 AMPK/VASP 기능의 특성 규명

국문 초록 (Abstract)

1987년 독일 뷔르츠부르그 의과대학의 임상 및 병리생화학 연구소에서는 인간의 혈소판 안에서 VASP (vasodilatator stimulierte phosphoprotein, 혈관확장자극 인단백질)를 세계 최초로 발견하였다. 초파리 단백질인 Ena와 인간 단백질인 VASP는 생물학적으로 많은 유사성을 보이기 때문에 이러한 단백질군을 Ena-VASP 군(family)이라고 정의하였다. 이 Ena를 포유동물에서는 Mena (mammalian enabled)라고 부른다.

VASP는 액틴필라멘트들을 따라서 풍부하게 분포되어 세포 운동에 관여한다. 혈소판의 응집이 일어나 심장마비와 졸도를 일으킬 때, VASP가 혈소판의 활성화를 방해한다. 특히 고농도의 VASP가 혈소판과 혈액의 다른 세포들 안에 포함되어 있는데, VASP는 당단백질인 GP IIb-IIIa 응집시키고 그물망을 형성하여 혈소판의 활성화를 억제한다.

암은 혈관신생(angiogenesis)을 통하여 증식과 전이를 하게 된다. 본 연구자가 독일에서 연구를 하려는 이유는, 첫째, 오직 뷔르츠부르그 의과대학만이 VASP/Mena 단백질이 결핍된 형질전환 생쥐들을 보유하고 있어, 이 분야의 연구가 지금까지 세계의 어떤 다른 연구소에서도 전혀 시도되지 않은 주제이고, 둘째. 오직 이 대학만이 VASP 단일항체(monoclonal antibody)를 보유하고 있기 때문이다.

또한 본 연구자가 VASP 및 AMPK를 공동으로 연구하려는 이유는 첫째, VASP는 AMPK의 기질인데, VASP의 아미노산 위치에 따라 Ser-157, Ser-239, 그리고 Thr-278 부위에서 단백질 키나아제에 의해 인산화되고, Ser-Thr 키나아제 역할을 하는 AMPK가 여기에 관여한다. 둘째, 세포 내의 항상성을 유지시키는데 중요한 역할을 하는 AMPK가 암세포의 증식에 관여하기 때문이다.

AMPK에 의해서 중재되는 VASP의 인산화는 암 전이 과정에서 혈관내피세포와 모세혈관의 생성에 필요한 세포이동(cell migration)에 관여한다. 즉 VASP의 인산화는 세포 안의 액틴(actin) 형성을 조절하기 때문에, 혈액 내에 존재하는 혈소판의 응집과 매우 밀접한 관계가 있다. 따라서 본 연구에서는, 첫째, Mena, VASP 또는 Mena/VASP 가 모두 knock out된 형질전환 생쥐들을 통하여 Mena/VASP 단백질의 기능을 규명하고자 한다. 둘째, 혈관신생(angiogenesis)은 이미 존재하는 혈관으로부터 새로운 미세혈관이 생성되는 것인데, VASP/AMPK 신호경로를 이용하여 항암후보 물질들을 탐색 및 개발하고자 한다.

1) VEGF는 다양한 세포 형태로 여러 조직들에서 관찰되며, 종양 혈관신생에 매우 중요한 역할을 한다. 시험관 내에서(in vitro) VEGF는 내피세포(endotherial cell)의 증식 및 이주 그리고 모세관 구조의 형성을 자극한다. 그러므로 VASP/AMPK 신호경로를 이용하여 VEGF의 발현을 연구한다.

2) 혈관신생은 서로 다른 수용체들을 활성화시키는 다양한 신호경로를 경유하여 일어나는데, ERK, JNK 그리고 COX-2와 연결된 MAPK 신호경로를 경유한 혈관신생을 분석하고자 한다.

3) COX-2는 전립선암, 유방암, 폐암, 대장암에서 높은 농도로 나타나며, COX-2의 과발현은 암의 전이와 매우 밀접한 관계가 있다. 종양형성(tumorigenesis)에서 가장 중요한 요인은 혈관신생인데, 이는 대부분 VEGF에 의해서 조절되며, VEGF는 COX-2의 영향아래서 혈관신생을 유도하기 때문에 혈관신생에서 VEGF/COX-2 신호경로의 연계성을 분석 하고자 한다.

4) NO의 합성이 방해되면 in vivo에서 혈관의 협착이 일어난다. 혈관신생에 관여하는 많은 성장인자들은 NO를 경유하여 작용하는데, VEGF는 NO의 방출을 증가시킨다. 또한 NO는 VASP를 인산화 하는데 있어서 방아쇠(trigger) 역할을 한다. 따라서 혈관신생에서 VASP/AMPK 신호경로를 이용하여 NO/VEGF 연계성을 분석하고자 한다.

5) 녹차에서 유래한 EGCG, Capsaicin, Resveratrol은 여러 단계의 신호경로를 통하여 암 증식을 억제하고 세포자살을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 본 연구에서는 혈관신생에서 VASP/AMPK 신호경로를 이용하여 이와 같은 항암후보 물질들을 찾고자 한다.

연구방법은 in vivo에서 Mena/VASP 기능을 규명하기 위하여 B16 흑색종 세포를 형질전환 생쥐들에게 주사한 후, 종양의 성장곡선을 작성하고, 시간대별로 나누어 현미경을 통하여 조직(혈관, 모세혈관, 혈관상피세포)을 관찰한다. In vitro에서는 혈관신생에서 VASP/AMPK 신호경로를 분석하기 위하여 MTT assay, FACS, Western blotting, ELISA assay, chromatin staining, NO (nitric oxide) test, Reactive Oxygen Species (ROS) test, SEM 및 TEM을 통한 암세포의 형태적인 변화를 관찰하고, 이러한 실험을 통하여 확인된 항암효과를 알아보기 위하여 B16-melanoma 세포를 생쥐에 주사한 후, 종양의 성장 과정을 조사한다.