소의 간 Cytosol Aldehyde Reductase의 정제 및 반응 Mechanism에 대한 연구 = Purification and the Probable Reaction Mechanism of Bovine Liver Cytosol Aldehyde Reductase

국문 초록 (Abstract)

소의 간에는 두 가지 aldehyde reductase [ALR : EC 1.1.1.2]가 존재하는 것으로 알려져 있는데 그 중 p-nitrobenzaldehyde에 대한 $K_m$값이 큰 high $K_m$ ALR을 황산암모늄 분별침전, DEAE-sephacel chromatography, hydroxyapatite chromatography, Sephacryl S-300 gel filtration, blue sepharose CL-6B chromatography 등의 방법으로 간균질액의 비활성도보다 비활성도가 497배가 되게 정제하였다. SDS-PAGE 방법으로 측정한 subunit 분자량은 39KD이었고 sephacryl S-200 gel filtraion 방법으로 측정된 native 분자량은 39.8 KD인 것으로 보아 monomer임을 알 수 있었으며 최적 pH는 6.5이었다. p-nitrobenzaldehyde, succinic semialdehyde에 대한 $K_m$값은 각각 $6.0{\times}10^{-5}M$과 $1.6{\times}10^{-4}M$로서 아주 낮았으나 acetaldehyde, propionaldehyde, indole-3-acetaldehyde, ${\gamma}-aminobutylaldehyde$와는 반응하지 않은 것으로 보아 이 효소는 방향성 aldehyde에 특이하게 작용하는 것으로 생각되며 특히 succinic semialdehyde에 대한 $V_{max}/K_{m}$이 큰 것은 이 효소가 GABA 대사와 밀접한 관계가 있는 것으로 생각된다. Thiol이기에 작용하는 p-hydroxymercuribenzoate, arginine 잔기 에 작용하는 2,3-butanedione, lysine 잔기에 작용하는 pyridoxal-5'-phosphate 등에 의해 효소활성이 크게 억제되었는데 이려한 억제현상이 $NADP^+$, NADPH 등에 의해 완화되는 것으로 보아 본 연구에서 사용한 변형시약들이 보조효소 결합부위에 있는 cystein, arginine, lysine 잔기들에 작용하는 것으로 생각된다. 여러 가지 금속이온 $(Zn^{2+},\;Ca^{2+},\;Mg^{2+},\;Li^{+},\;Mn^{2+})$은 이 효소의 활성에 별다른 영향을 미치지 않았으며 초기속도 실험결과에 의하면 high $K_m$ ALR은 sequencial mechanism에 의해 반응이 진행되는 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

High $K_m$ aldehyde reductase [ALR : EC. 1.1.1.2] having high Km for p-nitrobenzaldehyde of bovine liver cytosol fraction was separated and purified by the methods of ammonium sulfate precipitation, DEAE-sephael chromatography, hydroxyapatite chromatography, sephacryl S-300 gel filtraion and blue-sepharose CL-6B affinity chromatography. Molecular weight of native high $K_m$ ALR was determined to be 39.8 KD by sephacryl S-200 gel filtraion and subunit molecular weight of this enzyme was found to be 39 KD by SDS-PAGE, suggesting this enzyme is a monomer. The optimum pH of this enzyme is 6.5. This enzyme is relatively stable at $38^{\circ}C$, but its activity decreased rapidly as the temperature increased up to $50^{\circ}C$. $K_m$ of this high $K_m$ ALR for p-nitrobenzaldehyde and succinic semialdehyde was $6.8{\times}10^{-5}M$ and $1.6{\times}10^{-4}M$ respectively and its high $V_{max}/K_{m}$ value for succinic semialdehyde suggested that this enzyme might be closely related to GABA metabolism. This enzyme was inactivated by thiol specific reagent p-hydroxymercuribenzoate(PHMB) but the enzyme inactivation by PHMB was protected by $NADP^+$ and/or NADPH. Arginine specific reagent 2,3-butanedione inhibited this enzyme and the reaction order with respect to 2,3-butanedione was 0.86. Enzyme inactivation by 2,3-butanedione was also protected by $NADP^+$. Lysine specific reagent pyridoxal-5'-phosphate inactivated this enzyme and the inhibition was also protected by $NADP^+$. These results implied that cystein, arginine and lysine residues might be located at the coenzyme binding site. Initial velocity study indicated that bovine liver cytosol ALR follows a sequencial mechanism.