식물내생세균 Burkholderia cepacia EB215로 부터 분리한 항균물질의 특성규명 = Characterization of an antifungal substance isolated from an endophytic bacterium, burkholderia cepacia M EB215

국문 초록 (Abstract)

식물 내생세균을 이용한 채소병 방제용 미생물살균제를 개발하기 위하여 고추, 오이 등의 5가지 식물체의 여러 건전 조직으로부터 총 260개의 식물내생세균을 분리하였다. 항균활성이 있는 균주를 선발하기 위하여 분리한 260개의 식물내생세균을 토마토 역병(P. infestans), 오이 탄저병(C. orbiculare), 토마토 잿빛곰팡이병(B. cinerea), 보리 흰가루병(B. graminis f. sp. hordei) 및 오이 모잘록병(P. ultimum) 등의 5가지 식물병에 대하여 in vivo 항균활성을 조사하였다. 그 결과, 총 50개의 균주가 5가지 식물병 중 1가지 이상의 식물병에 대해 90% 이상의 방제활성을 보였다. 이렇게 효과가 우수한 균주들에 대해서는 그 균주들의 액체 배양액을 3배와 9배로 희석하여 다시 항균활성을 검정하였다. 그 결과, 토마토 역병에 대해서는 EB072와 EB215 균주가 높은 항균활성을 보였으며, 3배 희석액 처리시 두 균주 모두 70% 이상의 방제가를 보였다. 오이 탄저병에 대해서는 희석 배수를 달리하여도 EB040균주와 EB052균주, EB081, EB102, EB215 등의 균주가 비교적 우수한 항균활성을 보였다. 보리 흰가루병에 대해서는 EB072균주와 EB081, EB120균주가 높은 항균활성을 보였고, 오이 모잘록병에 대해서는 EB055균주와 EB056, EB069, EB102 균주가 높은 항균활성을 보였으며 9배 희석액 처리시 네 균주 모두 70% 이상의 방제가를 보였다. EB072균주와 EB081, EB102 균주의 경우에는 2가지 이상의 식물병에 대하여 우수한 항균활성을 보였다. 이중 오이 탄저병에 대하여 효과가 우수한 균주들에 대하여 고추 탄저병원균인 C. acutatum에 대한 대치배양을 실시하였다. 그 결과 EB054균주와 EB081, EB151, EB215균주가 우수한 활성을 보였으며, 그 중에서도 EB215가 가장 높은 활성을 보였다. In vivo에서 오이 탄저병에 대하여 효과가 우수하게 나타났고, 또한 in vitro에서 고추 탄저병균의 균사 생육에 대하여 높은 항균활성을 보인 식물내생세균인 EB215 균주로부터 항균물질의 분리 및 동정을 실시하였다. EB215 균주는 여러 생리·생화학적 특성 조사와 Biolog test, 16S rDNA sequence 결과들을 종합하여 Burkholderia cepacia로 동정되었다. 대량 배양한 B. cepacia EB215 균주의 추출물로부터 silica gel column chromatography와 preparative TLC 등을 통하여 하나의 활성물질을 순수 분리하였으며, 구조 동정을 위해 질량분석과 핵자기 공명분석을 실시한 결과 pyrrolnitrin으로 동정되었다. B. cepacia EB215로부터 분리한 pyrrolnitrin은 고추 탄저병, 벼 도열병 및 벼 잎집무늬마름병에 대해서는 11.1 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 90% 이상의 방제활성을 나타내었고, 오이 탄저병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 밀 붉은녹병에 대해서는 33.3 ㎍/㎖ 이상의 농도 이상에서 90% 이상의 방제활성을 보여 주었다. 이러한 결과들은 각각의 기존 약제들과 그 효과가 유사하거나 더 우수하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In order to develop a new microbial fungicide for the control of vegetable diseases using endophytic bacteria, a total of 260 bacterial strains were isolated from fresh tissues of 5 plant species. After they were cultured in broth media, their antifungal activities were screened by in vivo bioassays against Botrytis cinerea(tomato gray mold), Pythium ultimum(cucumber damping-off), Phytophthora infestans(tomato late blight), Colletotrichum orbiculare (cucumber anthracnose) and Blumeria graminis f. sp. hordei(barley powdery mildew). As the results of screening, 50 bacterial strains showed potent antifungal activities more than 90% against at least one of 5 plant pathogens. After liquid cultures of these strains were diluted 3 and 9 times, their antifungal activities were rescreened against 5 plant diseases. As the results of rescreening, EB072 and EB215 strains showed a potent antifungal activitity against tomato late blight, EB040, EB052, EB081, EB102 and EB215 against cucumber anthracnose, EB072, EB081 and EB120 against barley powdery mildew and EB055, EB056, EB069 and EB102 against cucumber damping-off. Bacterial strains EB072, EB081 and EB102 displayed potent disease control activities against more than 2 plant diseases. Among the bacterial strains with a potent antifungal activity against cucumber anthracnose, four bacterial strains, EB054, EB081, EB151 and EB215, also displayed a potent in vitro antifungal activity against Colletotricum acutatum, a fungal pathogen causing pepper anthracnose. A bacterial strain EB215 displayed the most potent antifungal activity among the four strains. A bacterial strain EB215 obtained from cucumber roots was identified as Burkholderia cepacia based on its physiological and biochemical characteristics, Biolog test and 16S rDNA gene sequence. An antifungal substance was isolated from the liquid cultures of B. cepacia EB215 strain by n-hexane partitioning, repeated silica gel column chromatography, and in vitro bioassay. Its chemical structure was determined to be pyrrolnitrin by mass and NMR spectural analyses. Pyrrolnitrin showed potent disease control activities more than 90% against pepper anthracnose, rice blast and rice sheath blight at 11.1 ㎍/㎖. In addition, it controlled against cucumber anthracnose, cucumber gray mold and wheat leaf rust at 33.3 ㎍/㎖ over 90%.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = ⅰ
• LIST OF TABLES = ⅲ
• LIST OF FIGURES = ⅴ
• SUMMARY = ⅵ
• Ⅰ. 서론 = 1
• 1. 연구 개요 = 1
• 2. 천연물질 = 4
• 1) 천연물질 탐색의 필요성 = 4
• 2) 천연물질에 의한 농약 개발 = 4
• 3. 항생물질 = 5
• 1) 항생물질의 이용 = 6
• 2) 항생물질의 작용 = 6
• 4. 식물내생세균(Endophytic bacteria) = 8
• 5. 연구 목적 = 10
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 11
• 1. 식물내생세균의 분리 및 항균활성 검정 = 12
• 1) 식물내생세균의 분리 = 12
• 2) In vivo 항균활성 검정 = 12
• (1) 시료의 제작 = 12
• (2) In vivo 항균활성 = 13
• 2. 선발 식물내생세균의 항균활성 검정 = 13
• 1) C. acutatum에 대한 in vitro 항균활성 조사 = 13
• 2) 배양액 및 ethyl acetate 추출물에 의한 항균활성 검정 = 14
• 3) 식물내생세균의 동정 = 15
• (1) 형태적, 생리˙생화학적 특성 조사 = 15
• (2) 분자생물학적 특성조사 = 15
• 3. Burkholderia cepacia EB215로부터 항진균물질의 분리 및 동정 = 15
• 1) 최적 배지 선발 = 15
• 2) 항균물질의 분리 및 정제 = 19
• (1) 항균물질의 구조 분석 = 21
• ① HPLC 분석 및 U.V. spetrum 분석 = 21
• ② 질량분석 = 22
• ③ 핵자기 공명분석 = 22
• (2) Pyrrointrin 의 in vivo 항균활성 검정 = 23
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 24
• 1. 식물내생세균의 분리 및 in vivo 항균활성 검정 = 24
• 1) 식물내생세균의 분리 = 24
• 2) 분리한 식물내생세균의 in vivo 항균활성 검정 = 26
• 2. 선발 식물내생세균의 항균활성 검정 = 33
• 1) C. acutatum에 대한 in vitro 항균활성 조사 = 33
• 2) 배양액 및 EtOAc 추출물에 의한 항균활성 검정 = 35
• 3) 식물내생세균의 동정 = 38
• (1) 형태적, 생리·생화학적 특성 조사 = 38
• (2) 16S rDNA 유전자 염기 서열 결정 = 39
• 3. B. cepacia EB215로부터 항진균물질의 분리 및 동정 = 41
• 1) 최적 배지 선발 = 41
• 2) 항균물질의 분리 및 정제 = 42
• 3) 항균물질의 구조 분석 = 43
• 4) Pyrrolnitrin의 in vivo 항균활성 = 50
• (1) 탄저병에 대한 in vivo 항균활성 = 50
• (2) 6가지 식물병에 대한 in vivo 항균활성 = 50
• Ⅳ. 요약 = 55
• Ⅴ. 참고문헌 = 57