애기똥풀 뿌리 부착 토양 진균에서 유래한 항암 활성 성분의 규명

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Chelidonium majus var. asiaticum (Baekgulschae), first recorded in 《Guhwangboncho》, is a plant used for medicinal purposes since ancient times. Pharmacological studies have reported its anti-inflammatory, antimicrobial, immunomodulatory, anticancer, hepatoprotective, and analgesic effects, mainly attributed to isoquinoline alkaloids such as chelidonine, sanguinarine, berberine, and chelerythrine.
Root-associated fungi are microorganisms that interact with plant roots and influence each other, producing a variety of bioactive secondary metabolites such as alkaloids, flavonoids, steroids, terpenoids, and quinones. These metabolites play key roles in enhancing plant resistance to pathogens and have great potential as sources of novel bioactive compounds for pharmaceutical applications.
Penicillium sp., originating from diverse ecosystems such as marine environments, soil, plant endophytes, and extreme habitats, produce various secondary metabolites, including polyketides, alkaloids, terpenoids, and peptides. As plant endophytes, Penicillium sp. generate structurally diverse bioactive compounds exhibiting antimicrobial, anticancer, antiviral, antioxidant, anti-inflammatory, and immunosuppressive effects.
In the course of research aimed at discovering anticancer bioactive compounds from root-associated fungus, fungi were isolated from the rhizosphere soil of Chelidonium majus var. asiaticum and cultured for metabolite analysis.
For dereplication, small-scale cultures were extracted with ethyl acetate, and extracts were analyzed using HPLC and UHPLC-HR-MS/MS, followed by feature-based molecular networking. Cytotoxic activity of the extracts was evaluated against HCT-8 and SK-OV-3 cancer cell lines using the MTT assay.
For isolation and purification, large-scale production was carried out by culturing fungal mycelia on Cheerios® cereal media for three weeks. Cultures were extracted with ethyl acetate, and extract was fractionated using silica gel and HP20ss column chromatography, and preparative and semi-preparative HPLC.
As a result, six new compounds including azaphilones (1~5) and meroterpenoid (6), along with 16 known azaphilones (7~21, 26), 2 phenolic compounds (22, 23), 2 pyrones (24, 25), 1 meroterpenoid (27) and 1 sterol (28) were isolated from Penicillium sp.
Structural elucidation of these compounds was performed using spectroscopic techniques such as 1D and 2D NMR, UV, HRMS, and ECD data. The relative configurations of the new compounds were established based on NMR analysis.
Additionally, their cytotoxic activities against the HCT-8 (colorectal cancer) and SKOV-3 (ovarian cancer) cell lines were evaluated, with compound 21 exhibiting the highest activity against HCT-8 cells and compound 17 showing the most potent effect against SK-OV-3 cells.
This study highlights the possibility that fungi inhabiting the rhizosphere of medicinal plants may produce distinctive secondary metabolites with unique pharmacological activities under the influence of plant-derived metabolic environments, further suggesting that such findings could provide an important foundation for the discovery of new anticancer lead compounds.

국문 초록 (Abstract)

Chelidonium majus var. asiaticum (백굴채) 는 《구황본초》에 처음 기록된 이후, 고대부터 약용으로 사용되어 온 식물이다. 약리학적 연구에 따르면, 이 식물은 주로 chelidonine, sanguinarine, berberine, chelerythrine 과 같은 아이소퀴놀린 알칼로이드에 의해 항염, 항균, 면역조절, 항암, 간 보호, 진통 등의 다양한 효과를 나타내는 것으로 보고되었다. Root-associated fungi 는 식물 뿌리와 상호작용하며 영향을 주고받는 미생물로, alkaloid, flavonoid, steroid, terpenoid, quinone 등 다양한 생리활성 2 차 대사산물을 생산한다. 이러한 대사산물은 식물의 병원체 저항성을 높이는 데 중요한 역할을 하며, 신약 개발을 위한 새로운 생리활성 화합물의 유망한 원천으로 주목받고 있다. Penicillium sp. 는 해양, 토양, 식물 내생균, 극한 환경 등 다양한 생태계에서 기원하며, polyketide, alkaloid, terpenoid, peptide 등의 물질을 생산한다. 특히 식물 내생균으로서 Penicillium sp. 는 구조적으로 다양한 생리활성 화합물을 생성하며, 항균, 항암, 항바이러스, 항산화, 항염, 면역억제 등 여러 약리활성을 나타낸다. 본 연구에서는 항암 활성을 지닌 생리활성 화합물 발굴 연구 과정에서, Chelidonium majus var. asiaticum 의 뿌리 주변 토양에서 root-associated fungi 를 분리하고, 대사산물 분석을 위해 배양하였다. Dereplication 을 위해 소량 배양 배양물은 ethyl acetate 로 추출하였고, HPLC 및 UHPLC-HR-MS/MS 를 이용하여 분석한 후, feature-based molecular networking 을 수행하였다. 또한 추출물의 세포독성 활성은 HCT-8(대장암) 및 SK-OV-3(난소암) 세포주를 대상으로 MTT assay 를 통해 평가하였다. 이후 분리 및 정제를 위해, 균사체를 Cheerios® 시리얼 배지에서 3 주간 배양하여 대량 배양을 수행하였다. 배양액은 ehtyl acetate 로 추출하였으며, 실리카겔과 HP20ss 컬럼 크로마토그래피, preparative 및 semi-preparative HPLC 를 이용해 분획하였다. 그 결과, 6 종의 새로운 azaphilones (1~5), meroterpenoid (6) 와 함께, 16 종의 알려진 azaphilones (7~21, 26), 2 종의 phenolic compounds (22, 23), 2 종의 pyrones (24, 25), 1 종의 meroterpenoid (27), 1 종의 sterol (28) 을 분리하였다. 이들 화합물의 구조는 1D 및 2D NMR, UV, HRMS, ECD 등 다양한 분광학적 기법을 이용하여 규명하였으며, 새로운 화합물들의 상대구조는 NMR 분석을 통해 규명하였다. 또한, 이들 화합물의 세포독성은 HCT-8 (대장암) 및 SK-OV-3 (난소암) 세포주를 대상으로 평가하였으며, 그 결과, HCT-8 세포에서는 화합물 21 이 가장 높은 활성을 보였고, SK-OV-3 세포에서는 화합물 17 이 가장 우수한 활성을 나타냈다. 본 연구는 Chelidonium majus var. asiaticum 의 root-associated fungi 인 Penicillium sp. 에서 유래한 화합물이 HCT-8 및 SK-OV-3 세포에 대해 효과적인 항암 활성을 나타냄을 강조하며, root-associated fungi 로부터 얻은 생리활성 화합물이 항암 신약 개발의 유망한 후보임을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• 1. 천연물 기반 신약 개발 1
• 2. 백굴채 (Chelidonium majus var. asiaticum) 1
• 2.1. 백굴채의 성분 및 생리활성 연구 1
• 3. Root-associated fungi 4
• 3.1. 식물 공생 진균 (Endophytic fungi) 4
• 3.2. 근권 미생물 (Rhizosphere fungi) 4
• 4. Penicillium sp. 5
• 4.1. Penicillium sp. 의 성분 및 생리활성 연구 5
• 5. 천연물 연구를 위한 중복 방지 기술 (Dereplication) 9
• 5.1. 중복 방지 기술 (Dereplication) 9
• 5.2. Molecular networking 9
• 6. 암과 항암제 (천연물 의약품 항암제) 10
• 6.1. 암 10
• 6.2. 항암제 10
• 6.3. 천연물 의약품 항암제 11
• 7. 연구 목적 11
• II. 실험 재료 및 방법 12
• 1. 실험 재료 12
• 1.1. 백굴채 12
• 1.2. Penicillium sp. 12
• 2. 기기 및 시약 13
• 2.1. 이화학적 확인 및 분리 정제 13
• 2.2. 세포 배양과 활성 측정의 기기 및 시약 14
• 3. Dereplication 소량 추출물 분획 15
• 3.1. 추출물 분획 15
• 3.1.1. 진균 배양 15
• 3.1.2. 소량 배양 추출 15
• 3.2. 소량 배양 추출물 HPLC 분석 16
• 4. Dereplication 분자 네트워킹 17
• 4.1. 초고성능액체크로마토그래피-탠덤 질량분석 (UHPLC-HR-MS/MS) 17
• 4.2. MS/MS data processing 17
• 4.3. Feature- based molecular networking 18
• 5. Dereplication 암세포에 대한 세포독성 활성의 측정 20
• 5.1. 세포 배양 20
• 5.2. 세포독성활성 측정법 20
• 6. 애기똥풀 뿌리 부착 토양 유래 진균의 성분 분리 21
• 6.1. 대량 배양 21
• 6.2. 추출 및 용매 분획 21
• 6.3. 성분 분리 22
• 7. 물리화학적 성상 및 분광학적 Data 25
• 7.1. CMRS3-4-F-7-2 (1) 25
• 7.2. CMRS3-4-F-9-2 (2) 25
• 7.3. CMRS3-4-G-2-2 (3) 25
• 7.4. CMRS3-4-G-4-2 (4) 25
• 7.5. CMRS3-4-G-7-1 (5) 25
• 7.6. Atlantinone C (6) 26
• 7.7. Geumsanol C (7) 26
• 7.8. Geumsanol D (8) 26
• 7.9. Geumsanol G (9) 26
• 7.10. Eupenicilazaphilone A (10) 26
• 7.11. WB (11) 26
• 7.12. Eupenicilazaphilone C (12) 27
• 7.13. Hypocrellone A (13) 27
• 7.14. Geumsanol B (14) 27
• 7.15. Geumsanol F (15) 27
• 7.16. Isochromophilone VIII (16) 27
• 7.17. Isochromophilone IV (17) 27
• 7.18. Isochromophilone VI (18) 28
• 7.19. Isochromophilone IX (19) 28
• 7.20. Sclerotioramine (20) 28
• 7.21 Sclerotiorin (21) 28
• 7.22. PD 3 (22) 28
• 7.23. Orthocetamol (23) 28
• 7.24. LL-P880β (24) 29
• 7.25. LL-P880γ (25) 29
• 7.26. Citridone H (26) 29
• 7.27. Atlantinone A (27) 29
• 7.28. 3,15-dihydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8(14),22-trien-7-on (28) 29
• Ⅲ. 결과 및 고찰 30
• 1. Dereplication 30
• 1.1. HPLC, LC-MS 및 세포독성 평가를 이용한 Dereplication 30
• 1.2. 후보 균주 선정 32
• 2. 화합물의 구조 동정 및 활성평가 34
• 2.1. 화합물의 구조 동정 34
• 2.1.1. CMRS3-4-F-7-2 (1) 34
• 2.1.2. CMRS3-4-F-9-2 (2) 41
• 2.1.3. CMRS3-4-G-2-2 (3) 48
• 2.1.4. CMRS3-4-G-4-2 (4) 55
• 2.1.5. CMRS3-4-G-7-1 (5) 62
• 2.1.6. Atlantinone C (6) 69
• 2.1.7. Geumsanol C (7), Geumsanol D (8) 76
• 2.1.8. Geumsanol G (9), Eupenicilazaphilone A (10), WB (11) 79
• 2.1.9. Eupenicilazaphilone C (12), Hypocrellone A (13) 84
• 2.1.10. Geumsanol B (14), Geumsanol F (15) 87
• 2.1.11. Isochromophilone VIII (16), Isochromophilone IV (17) 90
• 2.1.12. Isochromophilone VI (18), Isochromophilone IX (19) 93
• 2.1.13. Sclerotioramine (20), Sclerotiorin (21) 96
• 2.1.14. PD 3 (22) 99
• 2.1.15. Orthocetamol (23) 101
• 2.1.16. LL-P880β (24), LL-P880γ (25) 103
• 2.1.17. Citridone H (26) 105
• 2.1.18. Atlantinone A (27) 107
• 2.1.19. 3,15-dihydroxyl-(22E, 24R)-ergosta-5,8(14),22-trien-7-on (28) 109
• 3. 화합물의 암세포에 대한 세포독성 평가 111
• Ⅳ. 결론 113
• Ⅴ. 참고문헌 114
• Ⅵ. ABSTRACT 119