감마선 조사 마우스에서 면역세포 반응 연구 : Responses of the Immune Cells to Whole Body Gamma Irradiation in Mice

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Ionizing radiation is known to reduce the Th1 like function, but not the Th2 like function, resulting in a Th1/Th2 imbalance. While this has been known for some time, the mechanism behind the preferential suppression of the Th1 cell activation has not yet been explained. To begin with, we studied the effect of the antigen presenting cells on the differentiation of the helper T cells after ionizing irradiation and then elucidate changes of antigen presenting cells and Th cells in irradiated mice. Also, we studied whether NK1.1+T cells which were the most resistant against -irradiation impacted on the imbalanced immune response taking place after an irradiation.
The spleen cells of the whole body irradiated (WBI) mice showed a depression of the IFN- production in response to the T-dependent antigen. Also, the WBI mice immunized with DNP-KLH produced a low level of IgG2a, but a high level of IgE. The PACs of the WBI mice reduced IFN- production but increased the IL-4 production in a co-culture system with OVA-specific Th cells and PACs and in another co-culture with primary T cells and PACs in the presence of the antigen OVA. In the adaptively transferred mice, the similar effects of PACs of the WBI mice were observed. Also, the PACs of the WBI mice decreased the footpad swelling in the host mice receiving T and B cells from the normal mice. These results suggest that the antigen-presenting cells of the WBI mice contribute to induce the shifted differentiation of the helper T cells into the dominant Th2 cells.
To investigate a problem of APCs after WBI, the established OVA-specific Th cells were co-cultured with fixed OVA-primed PACs in the presence of the culture supernatant of the activated PACs. Although the OVA-specific Th cells were co-cultured with fixed OVA-primed PACs obtained from normal mice, the OVA-specific Th cells showed a decreased IFN- secretion in the presence of the culture supernatant of the activated PACs from the WBI mice. This result showed that problem of APCs was a trouble of cytokine secretion rather than membrane molecule of APCs. The spleen lymphocytes of the WBI mice showed a depression of the IFN- production against OVA, although the total IL-12 was highly secreted. However, the heterodimer IL-12, biologically active form, was less induced in the spleen lymphocytes of the WBI mice. The recombinant IL-12p70 restored the cytokine balance of the OVA-specific Th cells.
But the cytokine balance of the primary T cells of the WBI mice was not completely restored by the normal antigen presenting cells that abundantly secrete IL-12p70. So, we assumed that the regenerated T cells after WBI also had some problems, and then observed that the IL-12 receptor expression and intracellular levels of the STAT4 were much lower in the T cells of the WBI mice. These results suggest that the shifted response of the helper T cells after WBI is due not only to a significant suppression of the secretion of the IL-12p70 in the antigen presenting cells, but also to the lower expression of the IL-12 receptor on the T cells.
On the other hand, we have assumed that the cell population alive after irradiation plays an important role in Th1/Th2 balance. The purified CD90.2 positive cell population from the WBI mice produced significantly more Th2 type cytokines and also produced Th1 type cytokines at a not lower level than normal mice. We confirmed that the CD90.2 positive cell population from the WBI mice contained a higher absolute number of NK1.1+T cells. Also, the proportion of the NK1.1+T cells increased in the WBI mice. During investigating the reason for the preferential survival of the NK1.1+T cells, we found that the NK1.1+T cells were resistant to radiation-induced apoptosis in comparison with the conventional T cells. To investigate the function of the NK1.1+T cells in the WBI mice, anti-asialo GM1 antiserum was injected immediately after an irradiation and the depletion of NK and NK1.1+T cells in the spleen was confirmed 3 days after an irradiation. The depletion of NK and NK1.1+T cells in WBI mice resulted in increase of the frequency of mutation in bone marrow and spleen. Also, the WBI mice that were depleted of their NK1.1+T cells after an irradiation produced a larger amount of IgE and IL-4 and they also produced lower IL-12p70 in comparison with the WBI mice. Through these results, we have assumed that the NK1.1+T cells play an important role in the adaptation of our body under emergency conditions such as a radiation exposure, since NK cells are known to secrete IFN-, but not secrete IL-4.
Our findings revealed that the shifted response of the Th cells after a WBI exposure is due to a significant suppression of not only the secretion of IL-12p70 in the antigen presenting cells but also the expression of the IL-12 receptor of the Th cells. And also, it is suggested that the NK1.1+T cells that survive an early stage after an irradiation play an important role in the balance of the immune response at a late stage after an irradiation.

국문 초록 (Abstract)

면역세포들은 이온화 방사선에 민감한 세포로 알려져 있다. 면역세포들 중 Th 세포들은 생체내 면역 반응을 조율하며, 이는 이들이 분비하는 세포활성물질들과 세포막 단백질의 상호작용에 의해 이루어진다. 이와 같이 면역반응의 중추적 역할을 하는 Th 세포는 방사선에 저항성을 보이며, 이들 기능 중 Th1 세포 반응이 방사선조사 마우스에서 특별히 감소되어 있다고 보고되어 있다. 이와 같은 사실은 본 연구에 사용한 방사선 조사 마우스에서도 IFN- 및 IgG2a의 생산 감소, MLR 감소, DTH 반응 감소 결과 등을 통하여 확인되었다. 그러나 왜 Th1 세포 반응이 선별적으로 감소하는지에 대한 기전은 거의 밝혀져 있지 않다.
따라서 본 연구에서는 방사선조사 후 Th 세포의 불균형적인 반응에 대한 전체적인 기작을 규명하고자 하였다. 먼저, Th 세포의 마지막 분화를 결정짓는 항원제시세포(APCs)가 방사선 조사 후 재생성 되는 과정에서 어떠한 결함을 가지게 될 것이라는 가정과 재생성 된 Th 세포에도 결함이 있을 것 이라는 가정에 대해서 연구하였다. 그리고 방사선에 가장 저항성을 보이는 NK 세포와 NK1.1+T 세포가 방사선 조사 마우스에서 나타나는 Th1/Th2 세포 반응 불균형 및 돌연변이 발생에 어떠한 영향을 미치는지 연구하였다. 위 두 가지 관점에서 연구한 결과를 요약하면 다음과 같다.
I. 재생성된 항원제시세포와 Th 세포의 문제점
정상 마우스 또는 방사선 조사 마우스로부터 얻은 APCs와 OVA-specific Th 세포를 함께 배양하였을 때 IFN-와 IL-4의 분비 경향을 실험하였다. 그 결과, 방사선조사 마우스로부터 얻은 APCs는 OVA-specific Th 세포의 IFN- 분비를 감소시켰으며, IL-4의 분비는 증가시키는 것을 확인하였다.
먼저, 방사선 조사 마우스에서 재생성된 APCs가 어떠한 결함을 가지고 있는지 연구하기 위하여, 활성화된 APCs의 배양상층액의 존재 하에 OVA-primed APCs와 OVA-specific Th cell을 함께 배양을 하였다. 그 결과, 정상 마우스로부터 얻은 APCs를 OVA에 감작 시켜 OVA-specific Th cells와 함께 배양을 하더라도 방사선 조사 마우스로부터 얻은 활성화된 APCs의 배양상층액 존재 하에서는 OVA-specific Th cells가 IFN-을 적게 분비하였고, IL-4를 많이 분비하는 것을 확인하였다. 반대로, 방사선조사 마우스로부터 얻은 APCs를 OVA에 감작 시키고 OVA-specific Th cells와 함께 배양을 하였을 경우 정상 마우스로부터 얻은 활성화된 APCs의 배양상층액이 존재하면 OVA-specific Th cells는 IFN-을 많이 분비하였으며, IL-4를 적게 분비 하는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 우리는 방사선조사 마우스에서 재생성된 APCs의 결함은 항원에 의한 활성화 단계에서 분비되는 세포활성물질 이라고 추측 하였다. 더 나아가 우리는 그 세포활성물질이 Th 세포가 마지막으로 분화 시 중요하게 작용하는 IL-12p70이라는 것을 알았다. 결론적으로, 방사선조사 마우스의 활성화된 APCs는 생물학적 활성을 갖는 형태인 IL-12p70과 경쟁적인 IL-12p80이나 IL-12p40을 많이 생산하는 것으로 확인 되었다.
한편, 방사선조사 마우스로부터 얻은 primary T 세포와 IL-12p70을 풍부히 생산하는 APCs를 함께 배양 하여도 IFN- 분비가 완전히는 회복되지 않은 결과로부터 우리는 또 하나의 가능성을 추측하였다. 즉, 방사선조사 마우스의 T 세포에서 IL-12p70을 받아들일 수 있는 수용체 발현에 결함이 있음을 추측하였다. 방사선조사 마우스의 T 세포에서 IL-12 수용체를 측정한 결과, 수용체 1과 2 모두 그 발현이 감소하였다. 특히 수용체 2는 세포신호전달에 주요한 역할을 하는 것으로 그 발현이 더욱 감소 되어있는 것을 확인하였으며, 이로써 세포신호전달 매체인 STAT4의 발현 또한 감소되어 있는 것을 확인하였다.
II. 방사선조사 후 살아 남은 NK 세포와 NK1.1+T 세포의 중요성
본 연구에서 NK 세포와 NK1.1+T 세포가 방사선에 가장 내성을 보임을 확인하였고, 이들 세포는 방사선 조사 후 약 12일까지 정상마우스에 비해 그 비율이 높게 존재함을 확인 하였다. 다른 한편으로 우리는 방사선 후반에 나타나는 Th1/Th2 불균형적 반응은 방사선조사 후 살아남아 있는 세포들에 의해 영향을 받을 것이라고 가정 하였다. 이 가설을 증명하기 위해, 우리는 NK 세포와 NK1.1+T 세포를 방사선 조사 직후 제거하고, 골수세포와 비장세포에서 돌연변이율을 측정하였으며 또한 4주째 IgG2a, IgE, IFN-, IL-4, IL-12p70을 측정하였다. 그 결과, NK 세포와 NK1.1+T 세포를 방사선조사 직후 제거한 마우스의 골수세포와 비장세포 모두 에서 돌연변이율이 증가하는 것을 확인하였으며, 더욱 극심한 Th1/Th2 세포 불균형을 보이는 것을 확인하였다.
결론적으로 본 연구에서 방사선조사 마우스에서 나타나는 Th1/Th2 세포의 불균형적 반응의 원인은 활성화된 APCs가 IL-12p70를 적게 생산하는 것과 T 세포에서 IL-12 수용체 특히 2의 발현 감소에 있음을 밝혔으며, 또한 방사선에 가장 저항성을 보인 NK 세포와 NK1.1+T 세포가 방사선조사 후 나타나는 Th1/Th2 불균형적인 반응에 중요한 역할을 함을 확인하였다. 이와 같은 결과들은 방사선 조사 후 Th1/Th2 세포의 불균형적 반응에 의한 염증반응 및 만성질환을 이해하는데 기여할 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION = 1
• II. MATERIAL AND METHODS = 13
• 1. Mice = 13
• 2. Whole body irradiation (WBI) with gamma-ray = 13
• 3. Preparation of the spleen cells and peritoneal adherent cells = 13
• 4. Separation of the T cells and B cells by MACS = 14
• 5. Immunization and serum preparation = 15
• 6. Antibodies and standards for ELISA or flow cytometry = 15
• 7. Hemolytic plaque forming cell assay = 16
• 8. Mixed lymphocyte reaction (MLR) = 16
• 9. The measurement of cytokine and antigen-specific
• antibody (IgG2a and IgE) by the ELISA = 17
• 10. Establishment of antigen-specific Th cells = 18
• 11. Stimulation and co-culture of the OVA-specific T cells or primary T cells with APCs = 18
• 12. Adoptive cell transfer procedure = 19
• 13. Delayed-type hypersensitivity (DTH) reaction = 19
• 14. Co-culture of the OVA-specific Th cells and OVA-primed PACs in the presence of culture supernatant of PACs = 20
• 15. Analysis of the mRNA expression in the RT-PCR = 20
• 16. Detection of the apoptotic cells = 22
• 17. Detection of T cells, NK cells and NK1.1+T cells = 22
• 18. Cell stimulation by anti-CD3 and anti-CD28 antibody = 22
• 19. In vitro assay of cell survival after irradiation = 23
• 20. Depletion of NK1.1+T cells and NK cells in WBI mice = 23
• 21. Detection of micronuclei in polychromatic erythrocytes
• of bone marrow = 23
• 22. Detection of H-2Kb mutation in T cells = 24
• III. RESULTS
• 1. Repopulated antigen presenting cells induced an imbalanced differentiation of the helper T cells in the irradiated mice
• 1-1. The T cells that were slowly regenerated after WBI showed the depression of Th1-like function. = 25
• 1-2. APCs of WBI mice stimulate Th cells to secrete Th2-type cytokine rather than Th1-type cytokine in vitro. = 32
• 1-3. APCs from irradiated mice increase the response of Th2 but not Th1 in adoptively transferred mice. = 40
• 2. The factors effecting Th2-like immune response after irradiation are a low production of the IL-12 heterodimer in antigen presenting cells and a small expression of the IL-12 receptor in the T cells
• 2-1. Culture supernatant of OVA-stimulated PACs obtained from normal mice restores the balance of cytokine secretion
• of OVA-specific Th cells. = 45
• 2-2. A little production of IFN- in WBI mice is due to
• a little production of IL-12p70. = 49
• 2-3. Recombinant IL-12p70 (rIL-12p70) restores the balance
• of cytokine secretion of OVA-specific Th cells but not
• primary T cells. = 51
• 2-4. IL-12 receptor expression on T cells of WBI mice is much lower and that results in a low expression of intracellular level of STAT4. = 54
• 3. The NK1.1+T cells alive in irradiated mice play an important role in a Th1/Th2 balance
• 3-1. CD90.2 positive cell population obtained from the spleen of WBI mice induces both Th1 and Th2 type cytokines. = 60
• 3-2. Ionizing irradiation increases the proportion of
• TCR+NK1.1+ cells in the spleen. = 64
• 3-3. TCR+NK1.1+ cells are the most resistant to a radiation-induced apoptosis. = 67
• 3-4. The irradiated mice in which NK1.1+T and NK cells were depleted showed very high mutation frequency. = 70
• 3-5. Irradiated mice, in which NK1.1+T cells were depleted, showed More seriously imbalanced response of the Th cells = 70
• IV. DISCUSSION = 80
• V. SUMMARY = 91
• VI. REFERENCES = 94
• ABSTRACT = 111