이상 증식 신호 제어를 통한 획득 내성 극복 항암치료 요법에 관한 연구 = Anticancer therapy to overcome acquired resistance by targeting bypass or alternative pathway activation

국문 초록 (Abstract)

임상에서 1차 항암 치료 요법으로 화학항암제가 사용된다. 그러나 독성이 크다는 단점이 있다. 이에 대한 대체 치료제로 표적항암제가 사용된다. 기존의 화학항암제보다 독성이 적다는 장점이 있으나 장기간 투여 받을 시 환자는 이에 대한 내성을 획득하게 되어 재발하는 경우가 빈번하다. 암세포는 항암제에 노출될 때 생존 신호 억제, 세포내 스트레스 유발, 세포사멸 또는 자가포식작용 촉진 등이 나타나는데 이에 대한 회피 기작으로 암세포는 이상 증식 신호를 활성화 시켜 항암제 내성을 획득하게 된다.
유방암은 국내 여성암 중 가장 많이 발병되는 질환이다. 여성 호르몬인 에스트로겐은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER) 양성 유방암의 발달과 성장에 직접적으로 작용한다. 따라서 유방암 치료에 가장 보편적으로 사용되는 요법은 항 호르몬 요법이다. 타목시펜은 에스트로겐 수용체 양성 유방암 진단 환자에게 대표적으로 사용되는 항 에스트로겐 표적항암제이다. 타목시펜은 ER-α에 결합하여 구조 변형을 일으킨 후 신호를 차단하여 유방암의 성장을 억제한다. 그러나 타목시펜을 장기간 투여 받은 환자의 30%가 타목시펜에 대한 항암제 저항성을 획득하게 되는데 현재까지 명확한 대체 치료요법이 없어 이에 대한 기전 연구가 필요하다.
폐암은 국내외 암 발생율이 1위인 종양질환이며 5년생존율은 15%로 암중 사망률 1위이다. 폐암, 특히 비소세포성폐암(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)에서 발암 원인 중 하나는 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR) 신호의 과도한 활성화이다. 따라서, 이 신호를 매개하는 티로신 키나아제 (tyrosine kinase)의 ATP 결합 부위를 억제하는 ATP 경쟁적 억제제로 EGFR 인산화효소억제제 (tyrosine kinase inhibitor, TKI)가 폐암 치료의 표적항암제로 사용된다. 그러나 EGFR의 tyrosine kinase domain의 활성 돌연변이가 발견된 환자에서 EGFR-TKI에 대한 반응률이 낮고, 반응성이 좋았던 환자도 치료제 복용 10개월 전후로 EGFR-TKI에 대한 내성을 획득하게 되므로 이에 대한 극복 방안에 대해 연구가 필요하다.
폴로유사인산화효소 1 (Polo-like kinase 1, Plk1)은 세포 증식 과정의 세포분열 있어서 핵심적인 키나아제 이다. 본 논문에서 타목시펜 저항성 유방암 세포에서 Plk1 신호가 활성화 되어있으며 이를 억제 시 G2/M 기 진행이 차단되어 세포 증식이 억제되고, 더불어 암 줄기세포능의 억제를 동반하는 암 전이의 억제효과를 관찰하였다. 비장-간 전이 모델을 통하여 동물모델에서 전이가 억제됨도 확인하였다. 따라서 Plk1이 타목시펜 저항성 유방암의 치료 표적이 될 수 있음을 제시 하였다.
Plk1의 Polo-box domain (PBD)는 신호전달의 중요한 요소인 기질 결합 부위이다. Plk1 억제제의 개발과정에서 PBD를 표적으로 하는 Plk1 억제 신규 물질은 기존의 Plk1의 ATP 경쟁적 저해제보다 선택성이 우월하여 우수한 효능과 최소화된 부작용이 예측되는 유망한 치료표적이다. 본 논문에서는 404종의 신규 천연물 기원 유도체들을 스크리닝하여 Plk1 Polo-box domain(PBD)를 억제하는 LDD-3051, LDD-3052 화합물들을 도출하였다. LDD-3051, LDD-3051은 Plk1 PBD를 억제하여 S기 차단을 동반하는 암세포 증식의 억제효과를 나타내며, 타목시펜 저항성 유방암 이종이식 모델에서 경구 투여 시 항암효과가 있음을 규명하였다.
인슐린유사성장인자(insulin-like growth factor 1, IGF-1) 노출 시 인슐린유사성장인자 1 수용체(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)의 활성화는 소아 성장과 발달 과정에 중요한 역할을 담당하며 성인에도 지속적으로 작용하여 신체 유지에 필수적인 역할을 하는 호르몬이다. 암세포에서 IGF-1R는 과발현 되어있으며 세포증식 및 전이를 촉진하고 세포사멸을 억제한다. 본 논문에서는 EGFR-TKI에 대한 획득 내성 극복에 관련된 인자를 밝히고자, EGFR-TKI인 제피티닙(gefitnib), 엘로티닙(erlotinib) 혹은 오시머티닙(osimertinib)을 폐암 세포주에 장기간 처리하여 획득 내성을 보이는 암세포주를 구축하였다. 이 세포주들은 IGF-1 포함 8종의 암세포 증식에 관여하는 대표 성장인자를 처리시 EGFR-TKI 저항성 세포에서 IGF-1 대한 감수성이 특이적으로 증가함을 성장신호인Akt 활성화로 확인하였다. 또한, IGF-1R 신호를 억제 시 EGFR-TKI에 대한 감수성이 회복되고 세포자가사멸이 유도됨을 확인하였다.
소포체(endoplasmic reticulum, ER)은 리보솜에서 합성된 단백질들을 샤페론들의 도움으로 안정적인 형태로 완성시키고 미접힘 혹은 잘못 접힌 미성숙 단백질들은 세포질로 운송하여 분해시킨다. 암세포의 특징인 제어되지않는 세포 증식은 과도한 단백질 생합성을 야기한다. 세포는 미성숙 단백질이 누적될 경우 소포체 스트레스(ER stress)가 유발되어 세포사멸을 일으킨다. 암세포는 이에 대한 보호기작으로 미접힘 단백 반응(unfolded protein response, UPR) 신호 및 GRP78을 포함하는 샤페론 단백질들을 활성화하여 과도한 소포체 스트레스로 인한 세포사멸을 회피한다. 또한, UPR 및 샤페론 활성화는 항암제로 인한 세포사멸 유도를 억제하여 항암제 저항성을 유발한다. 본 논문에서는 EGFR-TKI 저항성 세포에서 소포체 스트레스를 수반한 GRP78의 발현 증가를 확인하였으며, IGF-1 처리 시 UPR 신호 활성화 및 GRP78의 발현 증가가 나타난다는 사실을 발견했다. IGF-1R 저해제 처리 시 GRP78의 발현이 억제되어 EGFR-TKI에 대한 감수성이 회복됨을 확인하였고, 이종이식 동물실험을 통해 EGFR-TKI 저항성 세포에서 proteasome 기능 억제를 통한 ER stress 유발물질인 bortezomib과 IGF-1R 저해제 병용투여 시 상승효과가 나타난다는 사실을 밝혔다.
본 논문에서는 항암제 저항성 세포에서 활성화 되는 이상 증식 신호 Plk1과 IGF-1R가 내성 극복의 치료표적임을 규명하였다. 타목시펜 저항성 유방암 세포에서 Plk1신호 억제 시 CSC억제를 수반하는 EMT 억제를 확인하였고, 신규 화합물 LDD-3051, LDD-3052가 Plk1 PBD를 억제하여 항암 효능을 보인다는 사실을 규명하였다. EGFR-TKI 저항성 폐암 세포에서 IGF-1R 신호를 억제 시 소포체 스트레스 조절을 매개하여 EGFR-TKI에 대한 감수성이 회복됨을 확인하였다. 따라서 항암제 획득 내성 암세포의 내성을 제어하는 신규 표적으로 Plk1과 IGF-1R을 제시하며, 이를 활용시 기존 항암제에 대한 내성 극복 치료 방안을 도출 할 수 있을 것으로 기대한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Although chemotherapy is most commonly used as first-line treatment in cancer patients, disadvantages such as high toxicity is an issue. On the other hand, target therapy carries varied benefits such as higher efficacy/potency, lower cytotoxicity, and orally availability. Despite their various advantages, some patients exhibit innate resistance, or acquire resistance within 10 months or more after receiving treatments.
Breast cancer is number one cancer that is most diagnosed in women. Estrogen plays a pivotal role in progression of breast cancer. Anti-hormone therapy is the first-line treatment in breast cancer. Tamoxifen, a selective estrogen receptor modulator, is an anticancer agent that is ubiquitously used for breast cancer. However, within 5 years, ~30% patients who received the treatment acquire resistance and experience relapse.
EGFR-TKIs (epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors) are world-widely used target therapy for lung cancer treatment. However, ~80% of patients who showed initial response, acquire resistance to them within 10 months. Thus, studies in underlying mechanism of acquire resistance to EGFR-TKIs are necessary. Therefore, elucidation of the mechanism and discovery of novel target for overcoming target-therapy resistance is necessary. This dissertation demonstrates elucidation of acquired resistance of targeted agents in cancers.
Polo-like kinase 1 (Plk1) is a key oncogenic regulator of completion of G2/M phase of the cell cycle. We assessed Plk1 expression in five chemo-resistant cancer cell types and found that Plk1 and its downstream phosphatase Cdc25c were selectively overexpressed in tamoxifen-resistant MCF-7 (TAMR-MCF-7) breast cancer cells. Real-time monitoring of cell proliferation also showed that TAMR-MCF-7 cells were more sensitive to inhibition of cell proliferation by the ATP-competitive Plk1 inhibitor BI2536 than were the parent MCF-7 cells. Moreover, BI2536 suppressed expression of epithelial–mesenchymal transition marker proteins and 3D spheroid formation in TAMR-MCF-7 cells. Using TAMR-MCF-7 cell–implanted xenograft and spleen–liver metastasis models, we showed that BI2536 inhibited tumor growth and metastasis in vivo.
In human, Plk family consist of five isoforms (Plk1-5). Plks are serine/threonine kinases characterized by the presence of a C-terminal Polo-Box Domain (PBD), which mediates protein interactions with substrates and regulators. Although Plk1 is an oncogene, other Plk isoforms such as Plk2, Plk3, and Plk5 are tumor suppressors. Several studies reported that Plk1 inhibitor mediates Plk3 inhibition which leads to diminution of anti-tumor effect. In order to overcome undesired inhibition of Plk3, PBD has been suggested as druggable target in several reports. In here, out of 404 compounds we identified novel Plk1 PBD inhibitors, LDD-3051 and LDD-3052, through high-throughput screening (HTS) Plk1 PBD binding assay. LDD-3051 and LDD-3051 suppressed cell proliferation of breast cancer cells via Plk1 PBD inhibition mediated S phase arrest. In TAMR-MCF-7 cell–implanted xenograft, we showed that LDD-3051 and LDD-3052 inhibited tumor growth when orally administrated. Taken together, our results suggest that Plk1 could be a novel target for the treatment of tamoxifen-resistant breast cancer and LDD-3051 and LDD-3052 are novel small-molecules with therapeutic potential for selectively inhibiting PBD of Plk1 in breast cancer.
Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) signaling pathway contributes in cell development, proliferation, and apoptosis in cancer cells. We assessed IGF1-R expression in 11 lung cancer cells and found that IGF-1R was upregulated in EGFR-TKI acquired resistant cells and selectively sensitive to its ligand, IGF-1. We found that ER (endoplasmic reticulum) stress involved UPR (unfolded protein response) was highly upregulated by IGF-1R activation in EGFR-TKI resistant cells. Combination efficacy of EGFR-TKIs and IGF-1R inhibitors showed that sensitivity to EGFR-TKIs were rescued by IGF-1R inhibition via ER stress regulation in EGFR-TKI resistant lung cancer cells.
In this study we demonstrated two bypass/alternative pathways (Plk1 and IGF1-R) that accounts for acquired drug-resistance in cancer. Targeting Plk1 overcome tamoxifen-resistance in breast cancer cells in vitro, in vivo. We reported anticancer effect of the novel natural product derived derivatives; LDD-3051 and LDD-3052. LDD-3051 and LDD-3052 possess inhibitory activity against Plk1, resulting in decreased in proliferative capacity, viability and tumor growth in vivo. Blockade of IGF-1R inhibited Akt activation and restored sensitivity against EGFR-TKIs in EGFR-TKI acquired resistant lung cancer cells. In EGFR-TKI acquired resistant lung cancer cells, UPR/ER stress was upregulated. When we inhibited IGF-1R pathway UPR/ER stress was suppressed and sensitivity against EGFR-TKIs was rescued. Our studies provide chemical and pharmacological information useful in the field of drug-resistance research with regard to anticancer target.

목차 (Table of Contents)

• 국문초록 i
• 목차 vi
• List of Tables ix
• List of Figures x
• List of Abbreviations xii
• I. 서론 1
• II. 시약 및 실험방법 9
• III. 연구결과 16
• IV. 고찰 88
• V. 참고문헌 99
• VI. Abstract 118
• VII. Curriculum Vitae 123
• VIII. 감사의 글 126