발기부전 치료를 위한 신경혈관 재생 전략: Argonaute 2 기반 미토콘드리아 보호와 침 기반 전기 자극 요법 : Chapter 1：Argonaute 2 restored erectile function and corpus cavernosum mitochondrial function by reducing apoptosis in a mouse model of cavernous nerve injury. Chapter 2：Acupuncture-Based Electrical Stimulation Restores Erectile Function via Neurovascular Regeneration in Streptozotocin-Induced Diabetic Mice. = Neurovascular Regeneration Strategies for Erectile Dysfunction : Argonaute 2-Mediated Mitochondrial Protection, and Acupuncture-Based Electrical Stimulation.

국문 초록 (Abstract)

배경: 장기간 당뇨병을 앓는 남성은 혈관내피세포 손상, 혈관주의세포(pericyte) 소실, 신경병증(neuropathy) 등으로 인해 일산화질소(NO) 생체이용률이 감소하고 PDE5 억제제에 대한 반응이 저하되어 발기부전을 겪는 경우가 많다. 신경조절적 전기자극(neuromodulatory electrical stimulation)은 신경혈관 회복(neurovascular repair)을 촉진하는 것으로 알려져 있으나, 침술 기반 전기자극(acupuncture-based electrical stimulation, ABES)이 당뇨병성 발기부전(diabetic ED) 개선 효과와 그 분자적 기전은 아직 명확히 규명되지 않았다.
목적: 본 연구는 STZ(스트렙토조토신)로 유도된 제1형 당뇨병 마우스 모델에서 ABES의 발기 기능 개선 효과와 그에 따른 분자적 기전을 규명하는 것을 목적으로 하였다.
재료 및 방법: 수컷 C57BL/6 마우스에 STZ(50 mg/kg)를 5일간 투여하여 당뇨병을 유도한 후, 8주 경과 시점에서 ABES를 시행하였다. 자극 부위는 SP6, CV4, CV1이었으며, 자극 조건은 1 ms 이중상(biphasic) 펄스, 12 Hz, 15분/일로 14일간 적용하였다. 발기 반응은 해면체 신경 전기자극 중 측정한 최대 및 총 해면체 내압(ICP)을 평균 수축기 혈압(MSBP)으로 보정하여 평가하였다. 또한 면역형광염색(PECAM-1, NG2, nNOS)과 면역블롯을 통해 angiopoietins(Ang1/Ang2), RAGE 신호전달, 스트레스 키나아제(p-p38, p-JNK), Akt/eNOS 인산화, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6), 산화 스트레스 지표(iNOS, p47-phox), 그리고 세포자멸사 관련 단백질(Bax/Bcl-2, TUNEL)을 분석하였다.
평가 지표: 발기 기능(최대 및 총 ICP/MSBP), 신경혈관 함량, 염증 및 산화 신호, 그리고 세포사멸 지표를 평가하였다.
결과: ABES 처치군은 발기 기능이 유의하게 회복되어, 최대 및 총 ICP/MSBP 비율이 대조군대비 약 85–90% 수준으로 향상되었다. 기전적으로 ABES는 혈관내피세포 및 신경세포에서 RAGE 발현을 억제하였고, Ang1/Ang2 균형을 혈관신생 촉진 방향으로 조절하였으며, eNOS 인산화를 증가시켰다. 또한 TNF-α, IL-6, p-p38, p-JNK 등 염증성 인자 발현이 감소하고, Akt 인산화는 유의하게 증가하였다. nitrotyrosine, iNOS, p47-phox 등 산화 스트레스 표지자 또한 감소하였으며, Bax/Bcl-2 비율 감소 및 TUNEL 양성 세포의 감소를 통해 세포자멸사 억제 효과가 확인되었다. 면역형광염색 결과, PECAM-1 양성 혈관내피세포, NG2 양성 혈관주의세포, nNOS 양성 신경세포가 모두 증가하여 신경혈관 재생이 뚜렷하게 관찰되었다.
임상적 의의: ABES는 혈관 손상, 신경장해, 염증, 산화 스트레스를 동시에 완화하는 비침습적 치료전략으로, 당뇨병성 발기부전의 약물치료 보조 혹은 대체 요법으로서의 가능성을 제시한다.
연구의 강점 및 한계: 본 연구는 AGE/RAGE 억제와 Akt/eNOS 경로 활성화에 기반한 ABES의 작용기전을 규명하였으나, 자극 강도·주기별 용량 반응성, 장기적 지속성, 그리고 안전성에 대한 추가 연구가 필요하다.
결론: ABES는 AGE/RAGE 연관 염증 및 산화 경로를 억제하고 신경혈관 재생을 촉진함으로써 STZ 유도 당뇨병 마우스의 발기 기능을 효과적으로 회복시킨다.

핵심어: 혈관신생, 당뇨병, 전기자극, 발기부전, 신경혈관 재생, 산화 스트레스

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Many men with long-standing diabetes experience erectile dysfunction driven by endothelial injury, pericyte depletion, and neuropathy that diminish nitric oxide bioavailability and blunt responses to PDE5 inhibitors. Neuromodulatory electrical stimulation may foster neurovascular repair, yet whether acupuncture-based electrical stimulation (ABES) benefits diabetic ED and through which mechanisms remains uncertain.
Aim: To determine the therapeutic effect of ABES on erectile function and define its molecular correlates in streptozotocin (STZ)–induced type 1 diabetic mice.
Materials and Methods: Diabetes was induced with STZ (50 mg/kg for 5 days). After 8 weeks, mice received ABES at SP6, CV4, and CV1 using programmed pulses (1 ms, 12 Hz, 15 min/day) for 14 days. Erectile responses were quantified as maximal and total intracavernous pressure (ICP) normalized to mean systolic blood pressure (MSBP) during cavernous nerve stimulation. Cavernosal tissues were profiled by immunofluorescence (PECAM-1, NG2, nNOS) and immunoblotting for angiopoietins (Ang1/Ang2), RAGE signaling, stress kinases (p-p38, p-JNK), Akt/eNOS, cytokines (TNF-α, IL-6), oxidative stress markers (iNOS, p47-phox), and apoptosis (Bax/Bcl-2, TUNEL).
Outcomes: Erectile function (max and total ICP/MSBP), neurovascular content, inflammatory/oxidative signaling, and apoptotic indices.
Results: ABES treatment markedly improved erectile function, with maximal and total ICP/MSBP ratios restored to approximately 85–90% of control levels. Mechanistically, ABES significantly suppressed RAGE expression in both endothelial and neuronal compartments, shifted the Ang1/Ang2 balance toward a pro-angiogenic profile, and enhanced eNOS phosphorylation. Inflammatory mediators, including TNF-α, IL-6, and phosphorylated stress kinases (p-p38, p-JNK), were notably downregulated, whereas phosphorylation of Akt was significantly upregulated. Oxidative stress markers (nitrotyrosine, iNOS, p47-phox) were reduced, and apoptosis was attenuated, as evidenced by a decreased Bax/Bcl-2 ratio and fewer TUNEL-positive cells. Immunofluorescence analyses further demonstrated increased PECAM-1-positive endothelial cells, NG2-positive pericytes, and nNOS-positive neurons, collectively indicating robust neurovascular regeneration.
Clinical Implications: ABES is a minimally invasive intervention that simultaneously targets vascular injury, neuropathy, inflammation, and oxidative stress in diabetic ED, supporting its evaluation as an adjunct or alternative to pharmacotherapy.
Strengths & Limitations: The study delineates an ABES mechanism involving AGE/RAGE suppression and Akt/eNOS enhancement; dose-response, durability, and safety in translational settings require further study.
Conclusions: ABES restores erectile function in diabetic mice by down-modulating AGE/RAGE-linked inflammatory/oxidative cascades and promoting neurovascular repair.

Keywords: Angiogenesis; Diabetes mellitus; Electrical stimulation; Erectile dysfunction; Neurovascular regeneration; Oxidative stress

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Cavernous nerve injury (CNI)–induced erectile dysfunction (ED) occurs in up to 85% of patients following radical prostatectomy or other pelvic surgeries. Phosphodiesterase type 5 inhibitors (PDE5Is), the standard first-line therapy for ED, exhibit limited efficacy in cases involving severe neurovascular damage. Effective management of CNI-induced ED requires therapeutic strategies capable of promoting both vascular and neural regeneration. Aim: To determine whether the overexpression of the Argonaute RNA-induced silencing complex (RISC) catalytic component 2 (Ago2) improves erectile function in mice after cavernous nerve injury (CNI). Materials and Methods: Lentiviruses containing Ago2 ORF mouse clone (Ago2 O/E) were used to overexpress Ago2, and lentiviruses ORF negative particles (NC) were used as a negative control. Three days before preparing the CNI model, lentiviruses was injected into the penises of 8-week-old male C57BL/6 mice. Animals were then divided into four groups: the sham operation control group and the CNI + PBS, CNI + NC, and CNI + Ago2 O/E groups. One week later, erectile function was assessed by electrically stimulating cavernous nerves bilaterally and obtaining intracavernous pressure parameters. Penile tissue was also collected for molecular mechanism studies. Outcomes: Erectile function (maximum and total ICP/MSBP), neuronal regeneration, mitochondrial function, reactive oxygen species levels, and apoptotic indicators were evaluated. Results: Ago2 overexpression improved erectile function in mice after CNI-induced ED. Immunofluorescence staining and Western blot analysis showed that under Ago2 overexpressing conditions, the contents of endothelial cells, pericytes, and neuronal cells increased in the penile tissues of CNI mice, and this was attributed to reduced apoptosis and ROS production. In addition, results also showed that Ago2 overexpression could restore penile mitochondrial function, thereby improving erectile function in CNI-induced ED mice. Clinical Implications: Ago2 plays a critical role in angiogenesis and protects the neurovascular unit from systemic inflammation–induced damage by reducing apoptosis and oxidative stress. These properties highlight its potential as a novel therapeutic target for ED. Strengths & Limitations: This study demonstrates that Ago2 overexpression improves erectile function in mice with CNI–induced ED by reducing oxidative stress and apoptosis while enhancing mitochondrial function. Nevertheless, comprehensive evaluation of potential side effects, long-term efficacy and safety, as well as nonclinical toxicity of Ago2 overexpression is required before clinical translation can be considered. Conclusion: The results demonstrate that Ago2 overexpression can reduce penile cell apoptosis, restore penile mitochondrial function, and improve erectile function in CNI-induced ED mice. Keywords: Ago2, apoptosis, mitochondria dysfunction, ROS, neural regeneration

국문 초록 (Abstract)

배경: 해면신경 손상(CNI)에 의해 발생하는 발기부전(ED)은 근치적 전립선절제술이나 기타 골반 수술 후 최대 85%의 환자에서 나타난다. 발기부전의 표준 1차 치료제인 PDE5 억제제(PDE5I)는 심한 신경혈관 손상이 동반된 경우 효과가 제한적이다. CNI로 인한 발기부전을 효과적으로 치료하기 위해서는 혈관과 신경 재생을 동시에 촉진할 수 있는 치료 전략이 필요하다.
목적: 본 연구의 목적은 해면체 신경 손상(cavernous nerve injury, CNI) 후 Argonaute RNA-induced silencing complex (RISC) catalytic component 2 (Ago2)의 과발현이 마우스의 발기 기능을 개선하는지를 확인하는 것이다.
재료 및 방법: Ago2 ORF 마우스 클론을 포함한 렌티바이러스를 이용하여 Ago2를 과발현(Ago2 O/E)시켰으며, 대조군으로 ORF 음성 입자를 포함한 렌티바이러스를 사용하였다(NC). 8주령 수컷 C57BL/6 마우스의 음경에 렌티바이러스를 주입한 후 3일 뒤에 CNI 모델을 제작하였다. 이후 실험군은 4 그룹으로 분류되었다: (1) Sham 수술 대조군, (2) CNI + PBS군, (3) CNI + NC군, (4) CNI + Ago2 O/E군. 수술 1주 후, 양측 해면체 신경을 전기적으로 자극하여 해면체 내압(intracavernous pressure, ICP)을 측정함으로써 발기 기능을 평가하였다. 또한 음경 조직을 이용하여 분자적 기전을 분석하였다.
평가 지표: 발기 기능(최대 및 총 ICP/MSBP), 신경 재생, 미토콘드리아 기능, 활성산소(ROS) 수준, 그리고 세포사멸 지표를 평가하였다.
결과: Ago2 과발현은 CNI로 유도된 발기부전 마우스에서 발기 기능을 유의하게 개선시켰다. 면역형광염색과 Western blot 분석 결과, Ago2 과발현 조건에서 혈관내피세포, 혈관주의세포(pericyte), 신경세포의 발현이 증가하였으며, 이는 세포자멸사(apoptosis)와 활성산소종(ROS) 생성 감소에 기인하는 것으로 확인되었다. 더불어, Ago2 과발현은 음경 내 미토콘드리아 기능을 회복시켜 발기 기능 향상에 기여하였다.
임상적 의의: Ago2는 혈관신생에서 중요한 역할을 하며, 전신 염증으로 인한 손상으로부터 신경혈관 단위를 보호하여 세포사멸과 산화 스트레스를 감소시킨다. 이러한 특성은 Ago2가 발기부전(ED)의 새로운 치료 표적으로 활용될 가능성을 보여준다.
연구의 강점 및 한계: 본 연구에서는 Ago2의 과발현이 해면신경 손상(CNI)으로 유도된 발기부전(ED) 생쥐에서 산화 스트레스와 세포사멸을 감소시키고, 미토콘드리아 기능을 향상시켜 발기 기능을 개선함을 보여준다. 그러나 임상 적용을 고려하기 위해서는 Ago2 과발현의 잠재적 부작용, 장기 효능 및 안전성, 비임상 독성 평가에 대한 철저한 검증이 필요하다.
결론: 본 연구는 Ago2 과발현이 세포자멸사를 억제하고, 미토콘드리아 기능을 회복함으로써, 해면체 신경 손상으로 유발된 발기부전을 효과적으로 개선할 수 있음을 입증하였다. 이는 신경 손상성 발기부전 치료의 새로운 분자적 접근 가능성을 제시한다.

핵심어: Ago2, 세포자멸사, 미토콘드리아 기능장애, 활성산소종(ROS), 신경 재생

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1 Argonaute 2 restored erectile function and corpus cavernosum mitochondrial function by reducing apoptosis in a mouse model of cavernous nerve injury 1
• 국문초록 1
• ABSTRACT 4
• INTRODUCTION 6
• MATERIALS AND METHODS 8
• RESULTS 12
• DISCUSSION 16
• CONCLUSION 19
• FIGURES 20
• 참고문헌 31
• Chapter 2 Acupuncture-Based Electrical Stimulation Restores Erectile Function via Neurovascular Regeneration in Streptozotocin-Induced Diabetic Mice 35
• 국문초록 35
• ABSTRACT 38
• INTRODUCTION 40
• MATERIALS AND METHODS 42
• RESULTS 47
• DISCUSSION 52
• CONCLUSION 54
• TABLE 55
• FIGURES 56
• 참고문헌 62