콩 단백질을 이용한 기능성 펩타이드 음료 제조에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 메주에서 분리한 Bacillus amyloliquefaciens FSE-68로부터 중성 단백분해효소와 염기성 단백분해효소를 다량 생산하기 위한 분리, 정제 조건을 확립하고, 분리, 정제한 효소로 가수분해한 분리대두단백 가수분해물을 시판되는 음료에 첨가하여 기능성 음료를 개발하고자 하였다. 본 실험에서는 효소생산의 scale up을 목적으로 발효조를 사용하고, 일반적으로 이용되는 침전과 투석의 과정 대신에 한외여과를 실시하고, 이온크로마토그래피 (Sepharose XL)의 정제방법을 택하였다. 한외여과 단계에서 중성 및 염기성 효소의 정제도는 각각 2.95, 2.47, 수율은 각각 83.5%, 70.1%, 이온크로마토그래피(Sepharose XL)단계에서 중성 및 염기성 효소의 정제도는 각각 9.9, 3.9, 수율은 각각 26.2%, 51.4%를 나타냈다. 한 회에 생산되는 효소의 단백질량은 중성 효소에서 39.1 mg, 염기성 효소에서 194.2 mg이었고, 총 3일의 시간이 걸렸다. 정제한 중성 및 염기성효소를 이용하여 분리대두단백 DH10%와 15% 가수분해물을 제조하여 ACE저해활성을 측정하고 음료제조에 사용하였다. ACE저해활성을 측정한 결과 중성효소에 의한 가수분해물 DH10%과 DH15%에서 각각 76.3%, 83.9%의 저해활성을 보였고, 염기성효소에 의한 가수분해물 DH10%와 15%에서 각각 68.8%, 74.1%의 저해활성을 보였다. 대조군으로 사용된 trypsin에 의한 가수분해물 DH10%와 15%에서 각각 57.7%, 67.1%의 저해활성을 보였다. 대두단백의 중성 효소와 염기성 효소에 의한 가수분해물의 관능특성을 평가한 결과 중성 효소로 만든 가수분해물에서 sucrose 2.35 g/L용액에 상당하는 단맛, citric acid 0.24 g/L용액의 신맛, NaCl 4.01 g/L용액의 짠맛, quinine-HCl 7.83 mg/L용액의 쓴맛이 있었고, 염기성 효소로 만든 가수분해물에서 sucrose 3.05 g/L용액에 상당하는 단맛, citric acid 0.27 g/L용액의 신맛, NaCl 3.50 g/L용액의 짠맛, quinine-HCl 7.81 mg/L용액의 쓴맛이 있었다. 항고혈압 효과가 있는 중성 및 염기성 효소에 의한 대두단백 DH15%의 가수분해물을 시중에 판매되고 있는 음료6가지에 고형분 함량이 0.8%가 되도록 첨가하여 차이식별검사를 시행하였다. 중성 효소에 의한 가수분해물 첨가 음료는 우유와 베지밀에서 유의적차이(p<0.05)를 보이지 않았고 염기성 효소에 의한 가수분해물 첨가 음료는 우유에서 유의적차이(p<0.05)를 보이지 않았다. 따라서 산업적으로 우유나 두유와 같은 제품에Bacillus amyloliquefaciens FSE-68로부터 정제된 중성 및 염기성 효소에 의한 대두단백 가수분해물을 첨가하면 고혈압 강하 기능성을 나타내는 음료를 개발할 수 있을 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Scale-up production of two proteolytic enzymes, neutral protease(Npr68) and alkaline protease(Apr68), from Bacillus amyloliquefaciens FSE68 originally isolated from Meju (a Korean fermented soybean paste), has been optimized in this study. Development and sensory evaluation of functional beverages using peptide mixtures obtained by hydrolyzing soybean protein isolate with either of two enzymes have also carried out.
In order to optimize the scale-up purification of the proteases for industrial production, B. amyloliquefaciens FSE68 was cultivated in a 5 L fermenter containing 3 L broth. The proteases were purified by a two-step purification including ultrafiltration followed by Sepharose XL column chromatography. The sequential purification with Sepharose XL resin resulted in the purification folds of 9.9 and 3.9, respectively for Npr68 and Apr68 with the yields of respective 26.2 and 51.4%. The results demonstrated that this sequential process of culturing in jar fermenter, ultrafiltration followed by Sepharose XL column chromatography, typically requiring 3 or 4 days, was suitable in the scale-up production. Antihypertensive functional beverage using angiotensinⅠconverting enzyme(ACE) inhibitory peptides as functional ingredients were developed and evaluated for possible industrialization. For the maximum production of ACE inhibitory peptides, the degree of enzyme hydrolysis was determined at 10 or 15% degree of hydrolysis(DH). In case of peptide hydrolysates by Npr68 and Apr68, the ACE inhibition activity was respectively 76.3, 68.8% at DH10%, 83.9, 74.1% at DH15%. In case of peptide hydrolysates by trypsin as a positive control, the ACE inhibition activity was respectively 57.7% at DH10%, 67.1% at DH15%. Sensory evaluation of the DH15% hydrolysate by Npr68 showed saltiness equivalent to NaCl 4.01 g/L, sourness of citric acid 0.24 g/L, sweetness of sucrose 2.35 g/L, bitterness of quinine-HCl 7.83 mg/L. On the other hand, that of the DH15% hydrolysate by Apr68 had saltiness equivalent to NaCl 3.50 g/L, sourness of citric acid 0.27 g/L, sweetness of sucrose 3.05 g/L, bitterness of quinine-HCl 7.81 mg/L. Discriminative sensory tests on 6 functional beverages prepared by adding 0.8% solid content of hydrolysates by Npr68 and Apr68 into beverages purchased from local market were carried out. Among the beverages were yoghurt, green tea, orange juice, milk, soymilk and coffee. Milk containing Npr68 hydrolysates was not significantly distinctive from control sample at p<0.05 level. Similarly, milk and soymilk containing Apr68 hydrolysates were not distinctive from control samples at p<0.05. These results suggest the possibility of industrial production of functional milk or soymilk containing antihypertensive peptides.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• Ⅰ. 서론
• Ⅱ. 실험재료 및 방법
• 1. 실험재료
• 1.1 균주 및 효소
• 1.2 균 배양 배지
• 1.3 가수분해물의 원료
• 1.4 ACE 저해활성 시약 및 효소
• 1.5 음료
• 2. 실험방법
• 2.1 효소의 정제
• 2.1.1 균주의 배양
• 2.1.2 한외여과(Ultrafiltration)
• 2.1.3 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography)
• 2.2 전기영동
• 2.3 단백질 정량
• 2.4 효소활성측정
• 2.5 분리대두단백의 가수분해
• 2.5.1 분리대두단백 분산액의 제조
• 2.5.2 가수분해도 결정
• 2.5.3 효소에 의한 분리대두단백의 가수분해물 제조
• 2.6 중성 및 염기성 효소에 의한 분리대두단백 가수분해물의 ACE저해활성 측정
• 2.6.1 완충액의 제조
• 2.6.2 기질의 제조
• 2.6.3 ACE의 제조
• 2.6.4 ACE저해활성 측정
• 2.7 음료의 관능검사
• 2.7.1 중성 및 염기성 효소 가수분해물의 관능검사
• 2.7.2 가수분해물의 고형분 함량 및 수율 측정
• 2.7.3 음료의 선정
• 2.7.4 차이식별검사
• Ⅲ. 결과
• 1. 효소의 정제
• 1.1 Bacillus amyloliquefaciens FSE68의 효소생산
• 1.2 효소의 정제
• 1.3 중성 및 염기성 효소의 활성 및 수율
• 2. 분리대두단백의 가수분해
• 3. 중성 및 염기성효소에 의한 분리대두단백 가수분해물의 ACE저해활성
• 4. 분리대두단백 가수분해물의 음료제조