Multiplex - PCR에 의한 먹는샘물 및 야채류로부터의 병원성 Yersinia enterocolitica의 신속검출

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 식품에 존재하는 Y. enterocolitica균의 신속한 점출방법을 조사하기 위하여 이균에 특이적인 ail, yst 및 virF 유전자와 Yersinia 속균을 구별하는 subgenus specific Y16S primer를 도입하여 multiplex PCR을 수행하였으며 Y. enterocolitica균의 검출 민감도와 특이도 및 먹는 샘물과 야채류에서의 적용실험을 각각 조사하였다. PCR특이성 실험에서는 Y. enterocolitica ATCC 27729균은 356 bp(ail), 134 bp(yst) 및 200 bp(Y16S) 3종의 유전자에 대한 DNA 증폭밴드를 나타내었으며, Y. entercolitica ATCC 9610 및 ATCC 23715는 yst와 Y16S 2종에만 증폭을 보였다. 반면에 기타 비병원성 Yersinia균인 Y. frederikseni, Y. intermedia, Y. kristenseni, Y. pseudotuberculosis 등은 Y16S에만 DNA 밴드를 나타내었으나 기타 세균인 E. coli ATCC 25392, Shi, dysenteri,m S. aureus ATCC 25923, L. monocytogenes ATCC 19111균에서는 어떤 primer에서도 특이 DNA 밴드를 확인할 수 없었다. PCR 민감도는 다른 유전자에 비하여 yst 유전자가 Y. enterocolitica균에 가장 높은 민감도를 나타내었고, Y16S 유전자는 속과 종에 관계없이 높은 민감도를 나타내었다. 따라서, 먹샘물이나 야채류에 대한 병원성 Yersinia균의 지표유전자로서 속을 대표하는 Y16S유전자와 종을 대표하는 yst유전자를 선정하였다. 수질 중 Y. enterocolitica의 검출한계를 알아보기 위하여 일반세균수가 3600 CFU/mL정도 함유된 먹는 샘물의 경우, DNA를 분리하지 않고 단순 열처리한 배양액을 DNA주형으로 사용하여 multiplex-PCR을 실시한 결과, Y16S와 yst 유전자 모두 7×10¹ CFU/mL 수준까지 검출할 수 있었으며, 일반세균수가 2.5×105CFU/g 정도 함유된 상치는 7 및 7×10¹ CFU/g, 일반세균이 7.1×10⁴ CFU/g정도 함유된 양송이버섯은 7 및 7×10¹ CFU/g 수준까지 검출할 수 있었다. 본 연구에서 나타난 바와 같이, 수질이나 야채류에서 Y16S와 yst 유전자를 혼합하여 Y. enterocolitica를 검출할 경우, DNA를 분리하지 않고 직접 whole cell을 lysate하여 DNA주형으로 사용하여도 2차 PCR을 수행할 경우에는 증균과정을 하지 않고도 민감도를 증진시키면서 신속하게 효율적으로 원하는 대상균을 검출할 수 있는 것으로 나타났다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The study was conducted to develope a rapid method for the detection of Yersinia enterocolitica in spring water and vegetables via multiplex polymerase chain reaction (PCR) technique using ail, yst, virF and subgenus-specific Y16S primers. Specificity and sensitivity of multiplex PCR and application of best primers for the detection of Y. enterocolitica from spring water and vegetables were investigeted. Y. enterocolitica ATCC 27729 strains gave 356 bp (ail), 200 bp (Y16S) and 134 bp (yst) bands, but Y. enterocolitica ATCC 9610 and ATCC 23715 strains gave 200 bp and 134 bp bands. In the meanwhile, non-pathogenic Yersinia species, such as Y. frederikseni, Y. intermedia, Y. kristenseni and Y. pseudotuberculosis gave only single 200 bp band, and other bacteria including Escherichia coli O157:H7 ATCC 25392, Shigella dysenteri, Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Listeria monocytogenes ATCC 19111 did not show any bands. Among primers, yst and Y16S primer showed the best sensitivity. Seven CFU/mL Y. enterocolitica cells could be detected with yst and Y16S primers and the sensitivity was significantly improved by the further 2nd PCR after 38 cycles of first PCR amplication. Spring water, cabbage and mushroom were inoculated with Y. enterocolitica to determine the sensitivity of multiplex-PCR for the rapid detection of Y. enterocolitica. Multiplex-PCR assay could detect 7 or 70 cells in spring water and vegetables using whole cell lysate with repeating PCR amplication.

목차 (Table of Contents)

• Abstract
  
• 서론
  
• 재료 및 방법
  
• 결과 및 고찰
  
• 요약
  
• 감사의 글
  
• 문헌