A genome-wide scale systematic screening for long-lived mutants using gene deletion library of fission yeast

국문 초록 (Abstract)

과학 기술의 발달로 인해 인간의 기대 수명은 점차 증가하고 있다. 따라서, 새로운 장수 관련 유전자 발굴이나 노화와 관련된 기전 연구 등 많은 장수 관련 연구가 이루어지고 있다. 분열효모는 장수 연구에 이용되는 모델 생명체 중 하나로서, 반수체 유전자 적중 라이브러리가 구축되어 있다. 현재 분열효모에서 장수 연구를 통해 TOR signaling pathway, Insulin/IGF-1 pathway, 그리고 PKA/Sty pathway 등의 수명 조절 기전이 보고된 바 있다. 본 연구에서는 반수체 유전자 적중 라이브러리를 이용하여 장수 균주를 스크리닝하였고, 장수 균주의 수명 조절 기전에 대해서 분석하고자 하였다.
본 연구에서는 분열효모 반수체 라이브러리리를 마이크로어레이를 통해 스크리닝한 뒤 3,400여 개 균주 각각의 intensity값을 비교하였고, 21개의 장수 후보군을 선정하였다. 정상 대조군과의 수명을 비교하기 위해 장수 후보군은 고체 배지에서 개별적으로 생존 능력을 검증하였고, 정상 대조군보다 오래 생존한 15개의 균주를 최종적인 장수 균주로 선정하였다. 장수 균주의 gene ontology를 분석하여 분자생물학적 특징에 따라 분류하였을 때, 아미노산 또는 탄수화물의 대사와 번역에 관련된 유전자가 다수 확인되었으며, 단백질의 분해 과정에 관련된 gene도 확인되었다. 장수 균주의 생장 곡선을 측정하였을 때, 대부분의 경우 정상 대조군에 비해 성장률이 저하되어 있었다. 정상 대조군 대비 성장률이 저하되지 않은 Δidn1과 Δpca1은 세포의 형태도 정상 대조군과 유사하였으며, 두 균주의 수명 증가 원인을 추가적으로 분석하였다. Δidn1은 정상 대조군에 비해 포도당 농도 감소로 인한 수명 증가가 미미하였으며, NADPH 생성의 감소로 인해 산화 스트레스에 민감하였다. 때문에 Δidn1의 수명 증가는 포도당 소비 감소를 통한 세포 내 에너지 조절과 연관된 것으로 보인다. Δpca1은 apoptosis 유도 물질을 처리하였을 때 정상 대조군에 비해 nuclear fragmentation이 적게 나타났다. 따라서 Δpca1의 수명 증가는 apoptosis의 감소로 인한 것으로 보인다. 장수 균주에 대한 심층적인 연구는 고등 생물의 수명 연구에 중요한 단서로서 활용할 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

With the advancement of science and technology, the life expectancy of humans is gradually increasing. Therefore, many studies related to longevity, such as discovering new genes related to longevity or studying aging-related mechanisms, are being conducted. Through longevity research in fission yeast, It has been reported that lifespan is regulated by the TOR signal pathway, Insulin/IGF-1 pathway, and PKA/Sty pathway. Fission yeast is one of the model organisms used for study of longevity and this laboratory has constructed a haploid gene deletion mutant library. In this study, long-lived mutants were screened using a fission yeast haploid deletion mutant library, and we tried to find out how they regulate the lifespan of fission yeast.
In this study, we have screened a fission yeast haploid deletion mutant library using microarray and analyzed the intensity values of about 3,400 strains, and 21 long-lived candidates were selected. To compare lifespan with normal control, long-lived candidates were individually tested for viability in solid medium, and 15 of mutants that lived longer than normal control were selected as the final long-lived mutants. As a result of analyzing gene ontology of long-lived mutants and classifying them according to molecular biological characteristics, many genes related to amino acid or carbohydrate and translation were identified, and genes related to protein catabolic process were also identified. The morphological characteristics and growth curves of the long-lived mutants were analyzed, and the long-lived mutants were classified according to the characteristics. When measuring the growth curve of the long-lived mutants, in most cases, the growth rate was lowered compared to the normal control. The Δidn1 and Δpca1, whose growth rate did not decrease compared to the normal control, were similar in morphological phenotype to the normal control, and the cause of the increase in lifespan of the two mutants was further analyzed. Δidn1 had less effect of increasing lifespan due to reducing glucose concentration compared to the normal control group, and was sensitive to oxidative stress due to decreased NADPH production. Δidn1 seems to increase lifespan by maintaining cell energy status due to decreased glucose consumption. When Δpca1 was treated with apoptosis-inducing substance, nuclear fragmentation was less than that of the normal control group. Δpca1 appears to have increased lifespan due to a decrease in apoptosis. In-depth study of long-lived mutants could be used as an important clue in the study of lifespan of higher organisms.

목차 (Table of Contents)

• Contents ⅰ
• List of Figures ⅲ
• List of Tables ⅳ
• Ⅰ. Introduction 1
• 1. Trend of longevity research 1
• 2. Fission yeast as a model for longevity research 3
• 3. Longevity-related pathways and genes studied in fission yeast 5
• 4. Purpose 7
• Ⅱ. Materials and Methods 8
• 1. Strains and Medium 8
• 2. Microarray 9
• 3. Solid medium inoculation 16
• 4. Gene Ontology (GO) analysis 18
• 5. Growth curve measurement 18
• 6. Cell morphology observation 18
• 7. Measurement of lifespan change according to glucose concentration 19
• 8. Stress-sensitivity measurement 19
• 9. Nuclear fragmentation measurement by stress-inducing substances 20
• Ⅲ. Results 21
• 1. Long-lived mutants screening using fission yeast haploid deletion mutant library 21
• 2. Individual viability verification of long-lived candidates 24
• 3. Gene Ontology analysis of long-lived mutants 27
• 4. Most of the long-lived mutants had a lower growth rate 29
• 5. Analysis of morphological phenotype of long-lived mutants 33
• 6. Changes in lifespan of Δidn1 according to glucose concentration 36
• 7. Δidn1 increased sensitivity to oxidative stress by decreasing NADPH production 40
• 8. Δpca1 is resistant to apoptosis-induced substances 43
• Ⅳ. Discussion 48
• Ⅴ. Reference 54
• 국문초록 59
• 감사의 글 64