김치에서 분리한 Lactobacillus curvatus KLC140 분리균주의 특성 및 플라스미드 pKLCA와 pKLCB의 클로닝과 유전적 분석

국문 초록 (Abstract)

숙성된 김치로부터 Lactobacillus curvatus KLC140균주를 분리하고, Plasmid DNA 두 종류를 분리하고 이들의 염기서열 분석하였다. 이를 바탕으로 shuttle 벡터를 개발하고, 유용 유전자의 발현과 식품 수준의 클로닝 벡터의 개발을 목적으로 실험을 수행하였다.
1. 분리된 균주는 Lactobacillus curvatus KLC140로 명명 하였고, 3종류의 plasmid DNA를 확인하였다. 이 중에서 1.490bp pKLCA와 3.353bp pKLCB를 클로닝 했다.
2. Plasmid DNA pKLCA와 pKLCB를 제한효소를 처리를 통하여 E. coli 벡터 pUC19과 pGEM-T-easy 벡터에 ligation하여 재조합 plasmid DNA를 구성하였다. 재조합 plasmid는 E. coli 안에서 안정성을 유지했고, Southern blotting에 의하여 확인 하였다.
3. Nucleotide sequence를 결정하고 NCBI를 통해 분석한 결과 pKLCA와 일치하는 염기서열이 없었고, pKLCB의 경우 일부분이 일치하는 염기서열이 있었다. 염기서열을 분석한 결과 pKLCA는 하나의 ORF(774bp, 257aa)를 가지고 있으며, pKLCB는 두개의 ORF(ORF1 : 618bp, 205aa; ORF2 : 458bp, 152aa)와 ori gene이라 생각되는 부위를 가지고 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In order to develop a food-grade cloning vector system which can be used in Lactobacillus sp., Lactobacillus strains were isolated from the Kimchi of Korea.
Among 200 isolated Lactobacillus strains, Lactobacillus curvatus KLC140 which contained three kinds of plasmid DNA were identified through biochemical, morphological, cultural and carbohydrate fermantation test. The size of plasmid DNA were 1.49kb, 3.35kb and 10kb, and were designated as pKLCA, pKLCB and pKLCC respectively.
The plasmid pKLCA was cloned in to the BamH I site of pUC19 and was cloned again to the pGEM-T-easy vector by PCR. The pKLCA had two EcoR I recognition sites and designated as pTKLCA.
The plasmid pKLCB had single Xba I and two Sph I recognition sites. It was cloned into the Xba I site of pUC19 and was designated as pUKLCB. The plasmid pKLCA and pKLCB was successfully transformed and stably replicated in E. coli DH5α. The pKLCA had one potential ORF(open reading frame) and it's nucleotide size was 774bp(258 amino acids). The pKLCB had two ORFs. The size of ORF1 was 618bp(205 amino acids). And the size of ORF2 was 458bp(205 amino acids). Potential origin of replication of pKLCB had a stem-loof structure.
For the construction of host-vector system, it will be needed to use food-grade selection marker such as genes that are related to carbohydrate metabolism and/or bacteriocin resistance.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 목차 = i
• ABSTRACT = v
• I 서론 = 1
• II. 재료 및 방법 = 6
• 1. Lactobacillus 의 분리와 동정 = 6
• 2. 사용한 Plasmids = 7
• 3. 배지 및 시약 = 9
• 4. Primer = 11
• 5. Plasmid DNA의 분리 = 13
• 6. 제한 효소의 처리와 전기영동 = 15
• 7. Lactobacillus plasmid DNA의 클로닝 = 16
• 8. PCR(Polymerase chain reaction)과 클로닝 = 17
• 9. Lactobacillus plasmid DNA의 염기서열 결정 = 19
• 9.1. Cyclic sequencing 및 purification = 20
• 9.2. Capillary 전기영동 = 20
• 10. Southern Hybridization = 21
• III. 결과 = 24
• 1. Lactobacillus 의 분리와 동정 = 24
• 2. Plasmid DNA의 양상 = 28
• 3. Plasmid의 클로닝 = 31
• 4. Southern bloting에 의한 clones의 확인. = 36
• 5. Lactobacillus curvatus KLC140의 pKLCA와 pKLCB의 염기서열 분석 = 38
• IV. 고찰 = 44
• V. 요약 = 49
• 참고 문헌 = 50