제브라피쉬 훈련면역의 세대 간 유전에서 부계 유래 마이크로 RNA（microRNA）의 영향

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 제브라피쉬（Danio rerio） 성어에서 자이모산을 이용한 훈련면역 유 도 조건을 확립하고, 부모 세대 훈련면역 유도가 자손의 생존율 및 Aeromonas hydrophila 감염 저항성에 미치는 영향을 평가하였다. 또한 부계 유전 가능성에 초점을 두고, 훈련면역 유도 수컷의 정자 small non-coding RNA를 분석하여 훈련면역의 세대 간 유전과 관련된 후보 microRNA를 탐색하였다. 성어에 자이모산을 농도별로 투여하여 훈련면역 유도 조건을 확립한 후, 재자극 및 A. hydrophila 감염을 통해 훈련면역에 따른 면역반응성과 A. hydrophila 감염 저항성을 평가하였다. 또한, 부모 세대의 훈련면역 유도 여부에 따라 자연교배 및 체외 인공수정으로 생산한 F1 자어의 자연사 비율과 감염 저항성을 비교하 였으며, 부계 유전과 관련된 후보 인자를 탐색하기 위해 훈련면역 유도 수컷과 대조군 수컷의 정자를 이용한 small RNA-seq 분석을 수행하였다. 자이모산 1차 접종 후 7일이 지난 시점에서도 훈련면역 유도군은 재자극 및 A. hydrophila 감염에 대해 향상된 면역 반응을 나타냈으며, 감염 후 생존율 또한 비훈련면역 유도군보다 높았다. F1 자손 실험에서는 부모 세대 훈련면역 유도군에 서 유래한 자어가 비훈련면역 유도군 자어보다 자연사 비율이 낮고 A. hydrophila 감염 후 생존율이 높았다. 이러한 경향은 부계 효과를 검증하기 위한 자연교배와 체외 인공수정 조건에서도 동일하게 확인되었다. 한편, 훈련면역 유도군 수컷의 정자에 대한 small RNA-seq 분석에서는 dre-miR-204-3p가 상향 발현된 차등발현 microRNA로 확인되었으며, 예측 표적 유전자는 발생, 신경발달, 세포 신호전달, 대사 조절 및 세포 항상성과 관련된 기능 범주에서 유의한 과표집이 확인 되었다. 이상의 결과는 부모 세대 훈련면역 유도가 F1 자손의 생존율 및 A. hydrophila 감염 저항성 향상과 연관될 수 있음을 시사한다. 또한 부계 조건에서도 자손의 감염 저항성 향상이 일관되게 확인되었으며, 훈련면역 유도군 정자에서 dre-miR-204-3p의 발현 증가가 관찰되었다. 이러한 결과는 dre-miR-204-3p가 부계 훈련면역의 세대 간 유전에 관여하는 후보 microRNA임을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study established zymosan-induced trained immunity conditions in adult zebrafish （Danio rerio） and evaluated whether parental trained immunity affected offspring survival and resistance to pathogen infection. This study also focused on paternal inheritance and analyzed sperm small non-coding RNA profiles from trained males to identify candidate miRNAs associated with offspring phenotypic changes.
Adult zebrafish received intraperitoneal injections of zymosan at 0, 25, or 50 μg/fish, and pro-inflammatory cytokine expression was analyzed. The 25 μg/fish treatment induced the highest upregulation of tnfa and il6, and this dose was selected as the trained immunity induction condition. Adult zebrafish were then subjected to primary zymosan stimulation, followed by a 7-day resting period. Immune responsiveness and survival were evaluated after secondary zymosan stimulation or Aeromonas hydrophila challenge. F1 larvae were produced by natural mating and in vitro fertilization according to parental trained immunity status, and their natural mortality and survival after A. hydrophila infection were compared. Sperm small RNA-seq was performed using sperm from trained and untrained males to identify candidate paternal factors.
Seven days after primary zymosan stimulation, trained adults showed increased immune responsiveness to secondary stimulation and A. hydrophila challenge. Trained adults also showed higher survival after A. hydrophila infection than untrained adults. In F1 offspring experiments, larvae derived from trained parents showed lower natural mortality and higher survival after infection than larvae derived from untrained parents. In particular, paternal trained conditions increased F1 larval survival after A. hydrophila infection under both natural mating and in vitro fertilization conditions. Sperm small RNA-seq identified dre-miR-204-3-3p as an upregulated differentially expressed miRNA in sperm from trained males. Predicted target genes of this miRNA were enriched in biological functions related to development, neurodevelopment, cell signaling, metabolic regulation, and cellular homeostasis.
These results showed that parental trained immunity was associated with increased survival and A. hydrophila resistance in F1 offspring. The reproducible increase in offspring infection resistance under paternal trained conditions, together with the upregulation of sperm dre-miR-204-3-3p, suggested that dre-miR-204-3-3p may be a candidate miRNA involved in paternal inheritance of trained immunity. Further functional validation of dre-miR-204-3-3p will be necessary to clarify the causal relationship between paternal sperm miRNA and offspring disease resistance.

목차 (Table of Contents)

• I. 서론 1
• II. 재료 및 방법 6
• 1. 훈련면역 유도 모델 확립 6
• 가. 제브라피쉬 성어의 훈련면역 유도 모델 확립 6
• 1) 사육관리 조건 6
• 2) 면역 유도 물질의 투여 농도 설정 7
• 3) 훈련면역 형성 여부 및 지속성 평가 11
• 4) 훈련면역 유도 후 병원체 감염에 대한 질병 저항성 평가 12
• 나. 자어의 세대 간 유전 모델 확립 14
• 1) 사육관리 조건 확립 14
• 2) 부모 세대 훈련면역 유도에 따른 F1 자어의 자연 생존율 비교 15
• 2. 훈련면역의 세대 간 유전 기전 규명 16
• 가. 체외 인공 수정 조건 확립 16
• 나. 부모 세대 훈련면역 유도 자손의 병원체 감염 후 생존율 확인 17
• 1) Aeromonas hydrophila 에 대한 자어의 반수치사농도 산정 17
• 2) A. hydrophila 감염에 대한 자어의 생존율 분석 18
• 다. 훈련면역 유도 후 정자 차등발현 microRNA 분석 19
• 1) 수컷 성어 훈련면역 유도 및 정액 채취 19
• 2) 정액 total RNA 추출 및 정제 20
• 3) small RNA library 제작 및 시퀀싱 21
• 4) small RNA-seq 데이터 전처리 및 품질평가 22
• 5) read 정렬, annotation 및 miRNA 정량 22
• 6) 차등발현 miRNA 분석 및 시각화 23
• 7) 차등발현 miRNA 표적 유전자 예측 및 기능 풍부화 분석 23
• III. 결과 25
• 1. 훈련면역 유도 모델 확립 25
• 가. 제브라피쉬 성어의 훈련면역 유도 조건 확립 25
• 1) 자이모산 접종 농도 설정을 위한 전염증성 사이토카인 발현 분석 25
• 2) 훈련면역 형성 여부 및 지속성 평가 28
• 3) 훈련면역 유도 후 병원체 감염에 대한 질병 저항성 평가 36
• 나. 자어의 세대 간 유전 모델 확립 46
• 1) 자연 교배 수정란의 시간대별 부화 양상 46
• 2) 부모 세대 훈련면역 유도에 따른 F1 자어의 자연 생존율 비교 48
• 2. 훈련면역의 세대 간 유전 효과 검증 및 분자적 기전 분석 50
• 가. 부모 세대 훈련면역 유도에 따른 F1 자손의 병원체 감염 후 생존율 평가 50
• 1) 자연교배 기반 부모 세대 훈련면역 유도 효과 검증 50
• 2) 자연교배 기반 부계 효과 검증 50
• 3) 체외 인공 수정 기반 부계 효과 검증 51
• 나. 훈련면역 유도 후 정자 차등발현 miRNA 분석 54
• 1) 정자 small RNA-seq 데이터 품질 평가 및 전처리 결과 54
• 2) 정자 small RNA 발현 프로파일 특성 60
• 3) 차등발현 miRNA 동정 66
• 4) 차등발현 miRNA 의 표적 유전자 예측 및 기능 풍부화 분석 68
• IV. 고찰 72
• 참고문헌 78
• 영문 초록 85
• 감사의 글 87