Overproduction of recombinant proteins using Bacillus subtilis sdp promoter in Escherichia coli = 대장균에서 Bacillus subtilis의 sdp 프로모터를 활용한 재조합 단백질의 발현

국문 초록 (Abstract)

재조합 단백질 발현에서 프로모터는 발현 수준, 시점, 조절 등을 결정하는 핵심 요소로, 적절한 프로모터 선택은 단백질 생산 최적화에 중요하다. 본 연구는 Bacillus subtilis의 sdp 프로모터를 활용하여 재조합 단백질 생산량을 증대시키고자 하였다. 연구에 사용된 sdp 프로모터는 본 연구실에서 개발된 가장 강력한 단백질 발현 카세트인 Psdp-4로, 해당 카세트의 샤인-달가노(SD) 서열을 SD1로 명명하였다. In-silico 분석으로 도출한 새로운 SD 서열 SD2를 SD1과 치환하여 녹색형광단백질(eGFP)과 인간 표피성장인자(hEGF)의 발현 플라스미드를 제작했다. 각각 pUB19-Psdp-SD2-egfp, pUB19-Psdp-SD1-His6-TEV-hegf, pUB19-Psdp-SD2-His6-TEV-hegf로, 이를 E. coli DH5α와 B. subtilis DB104에 형질전환하였다. eGFP의 형광 세기를 통해 프로모터의 세기를 비교한 결과, SD2는 SD1에 비해 E. coli DH5α와 B. subtilis DB104에서 각각 2.6배 높은 형광 세기를 나타냈다. 두 균주간 최대 형광 세기를 비교했을 때, SD2에서 E. coli DH5α의 24시간 형광 세기가 B. subtilis DB104의 36시간 형광 세기보다 1.1배 더 높았다. 또한, 를 적용한 sdp 프로모터는 IPTG 유도성 프로모터보다 더 높은 형광 세기를 나타냈다. hEGF 발현에서도 SD2는 SD1보다 더 높은 발현량을 나타냈고, 특히 SD2에서 E. coli DH5α가 B. subtilis DB104보다 11.1배 더 높은 발현량을 보였다. 이러한 결과는 sdp 프로모터에서 SD2가 E. coli DH5α와 B. subtilis DB104에서 모두 효과적이었으며, 특히 E. coli DH5α에서 더 높은 발현을 유도했음을 시사한다. 본 연구는 B. subtilis의 sdp 프로모터가 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 발현 시스템의 최적화에 기여할 수 있음을 확인했으며, 이는 산업적 규모에서 단백질 생산성을 크게 향상시킬 수 있는 잠재력을 보여준다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and methods 4
• 2.1. Bacterial strains, plasmids, and cultivation condition 4
• 2.2. In-silico design and evaluation of Shine-Dalgarno (SD) sequences 6
• 2.3. Plasmid construction 8
• 2.4. Bacterial transformation 12
• 2.4.1. Transformation of Escherichia coli 12
• 2.4.2. Transformation of Bacillus subtilis DB104 13
• 2.5. Measurement of recombinant proteins 14
• 2.5.1. Measurement of enhanced green fluorescent protein (eGFP) fluorescent 14
• 2.5.2. Human epidermal growth factor (hEGF) expression 16
• 2.6. Plasmid stability 18
• 2.7. Statistical analysis 19
• Ⅲ. Results 20
• 3.1. Selection of strong SD sequence based on TIR data 20
• 3.2. The effect of modification of SD sequence on the expression of recombinant proteins 24
• 3.2.1. Intensity of eGFP Fluorescence 24
• 3.2.2. Comparison of constitutive and inducible promoters in eGFP expression 28
• 3.2.3. Analysis of hEGF 30
• 3.3. Structure prediction of hEGF using AlphaFold2 33
• 3.4. Recombinant plasmid stability 35
• Ⅳ. Discussion 38
• Ⅴ. Conclusion 41
• Ⅵ. References 42
• 국문 초록 49