Evaluation of functions and tissue compatibility of Poly (D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) for tissue engineering applications : 조직공학적 응용을 위한 Poly (D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA)의 성능과 조직적합성 평가

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 두 가지로 나뉘어 진행되었다. Part I에서는 poly (D,L-lactic -co-glycolic acid) (PLGA)와 인체유래 진피 섬유아세포의 복합체의 성능과 조직적합성을 평가하였다. Part II에서는 조직공학에서의 응용을 위해 TiO_(2)를 코팅한 PLGA 필름을 개발하고 이를 평가하였다.
Part I : 조직공학과 상처 치유에 이용되는 생체재료는 세포의 성장과 조직형성을 물리·기계적으로 지지해 주어야 한다. 일반적으로, 조직공학에 이용되는 생체재료는 콜라겐, 알지네이트와 같은 천연재료와 bladder submucosa와 small-intestinal submucosa와 같은 세포가 없는 매트릭스, 마지막으로 polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), PLGA와 같은 합성 고분자로 나뉜다. 진피 대체물은 손상부위에 세포가 이동하도록 안내하는 역할을 해주어야 하고, 섬유아세포와 같은 진피조직의 세포에 대한 지지체로서의 기능을 해야 하며, 세포외기질들의 합성을 도울 수 있어야 한다. 손상부위에 잘 부착할 수 있어야 하고, 그 부위의 방어 기작과 상처치유에 도움을 주어야 하며, 탄력성과 항구성을 가져야 한다. 미적으로도 인간피부와 비슷한 형태를 나타낼 수 있는 성장력을 가져야 한다.
본 연구에서는 이전 연구에 근거하여, 3차원 다공성 PLGA 65/35를 선별하여 조직공학적 진피 대체물인 인체유래 진피 섬유아세포와 PLGA와의 복합체를 만든 후 이 복합체의 성능과 조직적합성을 평가하였다. 이를 위해, RT-PCR을 이용한 유전자 레벨에서의 제 1형 교원질을 확인하였고, 단백질 레벨에서의 교원질을 정량하였다. H & E 염색을 통하여 PLGA에서의 세포의 모양과 분포를 확인하였고, 면역조직화학 염색을 통하여 제 1형 교원질의 발현과 분포를 확인하였다.
Part II : 플라즈마 기술은 재료의 표면을 원하는 대로 쉽게 변형 시킬 수 있어 생체재료의 세포 친수성을 증가시키기 위해 이용되고 있다. 또한, 플라즈마 처리를 통해 고분자 재료를 물리·기계적 특성의 변화 없이 대량으로 변형시킬 수 있다. 세포 친수성은 조직공학 분야에서 세포 지지체로서 이용되고 있는 PLGA와 같은 생분해성 고분자에 있어서 매우 중요한 요소이다.
본 연구에서는 PLGA 표면과 세포와의 상호작용을 증진시키기 위해 PLGA 표면에 magnetron sputtering 방법으로 TiO_(2)를 코팅하였다. PLGA 표면의 변화는 contact angle과 X-ray photoelectron spectroscopy (XPS)로 확인하였다. 세포 부착과 생장은 MTT와 scanning electron microsopy (SEM)으로 확인하였다. TiO_(2) 코팅된 PLGA 필름은 코팅이 안된 PLGA에 비해서 친수성으로 변하였고 세포 부착과 생장이 더 증가하였음을 확인 할 수 있었다. 또한, macrophage를 이용한 실험에서도 코팅되지 않은 PLGA와 비슷한 부착력을 확인 할 수 있었다. 따라서, TiO_(2) 코팅된 PLGA는 생체 적합한 세포 지지체로서의 응용 가능성이 있음을 확인 하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study is divided into two categories. In part one, functions and tissue compatibility were evaluated in a composite of fibroblasts and poly (D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffold. In part two, TiO_(2)-coated PLGA film was developed and evaluated for tissue engineering.
Part I : In tissue engineering and wound-healing applications, scaffold materials are utilized to provide a mechanical support for cell growth and tissue formation. Generally, three classes of biomaterials have been used for engineering of genitourinary tissues: naturally derived materials (e.g., collagen and alginate), acellular tissue matrices (e.g. bladder submucosa and small-intestinal submucosa), and synthetic polymers [e.g., polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)]. A dermal substitute should function as a guide for cells moving into the repair area, and serve as a scaffold for cells such as fibroblasts, and help synthesize extracellular matrix (ECM) components. It must adhere to the wound bed, support local defense mechanisms and wound healing. It must be elastic and have long-term durability and growth potential similar to human skin with good aesthetic quality.
On the basis of previous study, we selected a three dimensional porous PLGA 65/35 and made composites of PLGA and human dermal fibroblast. The aim of this study is to develop the evaluation methods of function and tissue compatibility for tissue engineered dermal substitute.
This study was focused on the functional analysis and tissue compatibility of artificial dermal substitute. The experiments were performed and confirmed at a level of gene expression (RT-PCR), protein expression (total collagen quantities) and histological analysis.
Part II : Plasma technique can easily be used to introduce the desired functional groups or chains onto the surface of materials, so it has a special application to improve the cell affinity of scaffolds. Additionally, it has been demonstrated that plasma treatment is a unique and powerful method for modifying polymeric materials without altering their bulk properties. Cell affinity is the most important factor to be concerned with when biodegradable polymeric materials such as PLGA are utilized as a cell scaffold in tissue engineering.
Therefore, in order to improve PLGA surface/cells interaction, we modified PLGA surface with TiO_(2) using magnetron sputtering method. The changes of their surface properties have been characterized by means of contact angle measurement and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). To confirm cell attachment and proliferation, MTT assay and scanning electron microscopy (SEM) were carried out.
The results indicate TiO_(2)-coated PLGA film became hydrophilic and enhanced cell affinity and proliferation. We expect TiO_(2)-coated PLGA matrix can be a candidate for cell scaffolds in tissue engineering.

목차 (Table of Contents)

• Contents = i
• Figure legends = iii
• Abbreviations = v
• ABSTRACT = vi
• Part I. Evaluation of Functions and Tissue Compatibility of Poly (D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) for Tissue Engineered Skin = 1
• 1.1. Introduction = 1
• 1.2. Materials and methods = 3
• 1.2.1. Preparation of porous PLGA scaffold = 3
• 1.2.2. Human dermal fibroblast culture = 3
• 1.2.2. Cell seeding on PLGA scaffold = 3
• 1.2.3. RNA precipitation and RT-PCR for type I collagen = 4
• 1.2.4. Total collagen assay = 4
• 1.2.5. Histology and immunohistochemistry = 5
• 1.3. Results and discussion = 5
• 1.3.1. Gene expression of type I collagen = 6
• 1.3.2. Quantitative analysis for total collagen amount = 7
• 1.3.3. Morphological observation = 10
• 1.3.4. Immunohistochemical assay for type I collagen = 12
• 1.4. Conclusion = 14
• 1.5. References = 15
• Part II. Plasma Surface Modification of Poly (D,L-lactic-co-glycolic acid) Film for Tissue Engineering = 19
• 2.1. Introduction = 19
• 2.2. Materials and methods = 20
• 2.2.1. Surface modification of PLGA film = 20
• 2.2.2. X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis = 21
• 2.2.3. Water contact angle measurement = 24
• 2.2.4. Human dermal fibroblasts culture = 24
• 2.2.5. Human dermal fibroblast seeding on TiO_(2)-coated and uncoated PLGA = 24
• 2.2.6. Cell attachment and proliferation assay = 25
• 2.2.7. Scanning electron microscopy (SEM) analysis = 25
• 2.3. Results and discussion = 26
• 2.3.1. Surface composition of PLGA film = 26
• 2.3.2. Hydrophilicity of PLGA film = 26
• 2.3.3. Fibroblast attachment and proliferation = 29
• 2.3.4. Macrophage attachment on the TiO_(2)-coated and uncoated PLGA film = 33
• 2.4. Conclusion = 35
• 2.5. References = 36
• 국문요약 = 39