플루오린화 탄소 태그를 이용한 질산화 펩타이드의 선택적 분리와 질량분석학적 동정

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Protein tyrosine nitration (PTN) is a post-translational modification that is related to several acute or chronic diseases. PTN introduces a nitro group in the ortho position of the phenolic hydroxyl group of tyrosine residues. PTN has been shown to be involved in the pathogenesis of inflammatory responses, cancers, and neurodegenerative and age-related disorders. Furthermore, it has been proposed that PTN regulates signal cascades related to nitric oxide (NO？) production and NO-mediated processes. Although nitrated proteins as markers of oxidative stress are confirmed by immunological assays in various affected cells or tissues, it is not known how many different types of proteins in living cells are nitrated. Since protein nitration is a low-abundance post-translational modification, development of an effective enrichment method for nitrated proteins is needed to detect nitrated peptides or proteins from the limited amount of pathophysiological samples. In the present study, we developed an enrichment method using specific chemical tagging. Nitroproteome profiling using chemical tagging and mass spectrometry was validated by model proteins. Furthermore, we successfully identified numerous nitrated proteins from the Huh7 human hepatoma cell line.

국문 초록 (Abstract)

단백질 타이로신 질산화는 급성 또는 만성 염증과 관련된 전사 후 수식 중에 하나이다. 단백질 타이로신 질산화는 타이로신 잔기에 있는 페놀링 수산기의 ortho 위치에 질산기가 붙는 현상을 말한다. 질산화는 염증 반응, 암 그리고 퇴행성 신경질환과 노화의 발병에 관련되어 있다고 알려져 있다. 이 뿐만 아니라, 단백질 타이로신 질산화는 nitric oxide의 생성과 매개된 반응에 관련된 신호 전달 과정을 조절한다고 제안되어 왔다. 산화적 스트레스의 표지인자로서 질산화 단백질들은 다양한 세포와 조직에서 면역학적 분석법에 의해 확인되었지만 살아있는 세포 안에서 얼마나 다양한 형태로 질산화가 일어나는지는 알려져 있지 않다. 질산화 단백질은 소량으로 존재하기 때문에 이것의 분석을 위한 효과적인 enrichment 방법의 개발은 제한된 시료로부터 질산화 펩타이드 혹은 단백질의 동정을 위해 필수적이다. 최근 연구에서, 우리는 특이적 화학 tagging을 이용한 enrichfment 방법을 개발했다. 화학적 tagging과 질량분석기를 이용한 질산화 단백체의 동정은 모델 실험을 통해 확인 되었다. 더욱이, 우리는 간암세포에서 성공적으로 다수의 질산화 단백질들을 동정했다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction = 1
• 2. Material and Methods = 4
• 1. Materials = 4
• 1-1. Reagents = 4
• 1-2. Instruments = 5
• 2. Methods = 6
• 2-1. Lysis of the Huh7 Cell Line and Quantification = 6
• 2-2. Trypsin Digestion of BSA and Huh7 Cell Lysate = 7
• 2-3. Acetylation and Reduction Steps = 8
• 2-4. Fluorinated Carbon Tagging Step = 9
• 2-5. Fluorinated Solid Phase Extraction = 10
• 2-6. MALDI-TOF/TOF Analysis = 11
• 2-7. LC-ESI-IT-MS/MS Analysis = 12
• 2-8. Database Searches and Validation = 13
• 2-9. Gene Ontology (GO) Analysis = 14
• 3. Results and Discussion = 15
• 1. Confirmation of Chemical Conversions = 15
• 2. Separation of Fluorinated Carbon Tagged Peptides = 20
• 3. Enrichment of Nitropeptides in BSA Tryptic Peptide Mixture = 23
• 4. Identification of Endogeneous Nitroproteins from Huh7 Cell Lysate = 25
• 5. Bioinformatic Analysis of Enriched Nitro Proteins = 29
• 4. Conclusions = 34
• 5. Reference = 35
• 6. Abstract in Korean = 37
• 7. VITA = 38