Effect of Aldosterone on Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Human Peritoneal Mesothelial Cell

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Peritoneal fibrosis is one of the major causes of technical failure in patients on peritoneal dialysis (PD) for long period of time. Although the exact mechanisms of peritoneal damage during PD still remain unclear, epithelial-to-mesenchymal transion (EMT) of peritoneum has been emerged as an early and reversible mechanism of peritoneal fibrosis. Therefore, it is important to find the etiologic stimuli to induce peritoneal EMT with an understanding of pathogenetic process of EMT. Recent data revealed a pro-fibrotic role of aldosterone in various organ fibrosis. Human peritoneal mesothelial cell (HPMC) is known to have its own renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS), but it has not been investigated whether aldosterone induces EMT in HPMC and which mechanisms are responsible for aldosterone-induced EMT.
Method: HPMCs were isolated from human omentum. The presence of mineralocorticoid receptor (MR) in HPMC was identified by RT-PCR. EMT of HPMCs was evaluated by comparing the expression of epithelial cell marker, E-cadherin and mesenchymal cell marker, α-smooth muscle actin (α-SMA) after the stimulation with aldosterone (1-100 nM) and/or spironolactone, MR antagonist. Aldosterone-induced phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) and p38 MAPKinases and generation of reactive oxygen species (ROS) were assessed by Western blotting and DCF-DA staining of cells. Effect of MAPKinase inhibitors (SB20358, PD98059) or anti-oxidants [N-acetyl cystein (NAC), rotenone and apocynin] on aldosterone-induced EMT was evaluated as a potential mechanism of phenotypic transformation of HPMCs induced by aldosterone.
Results:
1)HPMC expressed human mineralocorticoid receptor.
2)Aldosterone induced EMT in cultured HPMC, expressed as a decrease in the expression of E-cadherin and an increase in the expression of α-SMA in dose- and time-dependent manner from a concentration of 10 nM and 48 hours of stimulation.
3)Spironolactone (1 μM) completely blocked aldosterone-induced EMT.
4)Aldosterone induced an activation of both ERK and p38 MAPK from 5 minutes of stimulation. PD98059, an inhibitor of ERK MAPK, attenuated aldosterone-induced EMT, however SB20358, an inhibitor of p38 MAPK, did not alter the expression of E-cadherin and α-SMA induced by aldosterone.
5)Aldosterone induced oxidative stress in HPMCs, and pre-treatment of cells with NAC or rotenone ameliorated the aldosterone-induced EMT. NAC also blocked aldosterone-induced activation of ERK.
Conclusion: Aldosterone induced EMT in HPMC by MR-dependent mechanism. Aldosterone-induced generation of ROS followed by an activation of ERK played a key role in aldosterone-induced EMT of cells. Further studies will be necessary to understand the pathogenetic mechanism of aldosterone-induced EMT after ERK activation and to verify the clinical implication of inhibition of RAAS on reversing peritoneal fibrosis and preserving peritoneal membrane in patients on peritoneal dialysis.

국문 초록 (Abstract)

연구배경: 복막 섬유화는 장기간 복막투석을 받는 환자에서 발생되는 중요한 합병증이다. 복막 손상의 기전에 관한 많은 연구에도 불구하고 복막 섬유화의 문제는 아직 해결되지 못하고 있는데, 이는 복막 변화의 초기 기전에 관한 이해 및 이에 관한 치료가 부족하기 때문이다. 최근 복막 섬유화의 초기 기전으로 복막중피세포의 상피-중간엽 이행의 중요성이 대두되고 있다. 알도스테론은 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템의 최종 생성물로 여러 장기 섬유화의 원인이 됨이 보고된 바 있다. 복막중피세포는 독자적인 레닌-안지오텐신 시스템을 보유하고 있음이 밝혀졌으나, 아직 알도스테론과 복막중피세포의 상피-중간엽 전이와의 관계는 연구된 바 없다. 본 연구에서는 알도스테론에 의한 복막중피세포의 상피-중간엽 이행 유무와 그 기전에 관해 알아보고자 하였다.
방법: 일차 분리, 배양한 복막중피세포에서 염류코르티코이드 수용체 (mineralocorticoid receptor; MR)의 발현 여부를 RT-PCR로 확인하였다. 알도스테론에 의한 복막중피세포의 상피-중간엽 이행 여부는 상피세포의 표지자인 E-cadherin과 중간엽세포의 표지자인 α-smooth muscle actin (α-SMA)의 발현을 비교하여 확인하였다. 알도스테론으로 extracellular signal-regulated kinase (ERK), p38 mitogen-activated kinase (MAPK)의 활성화 및 reactive oxygen species (ROS) 생성의 증가 여부를 각각 Western blot과 DCF-DA 염색으로 조사하였다. ERK 및 p38의 억제제인 PD98059 및 SB203580과 각기 다른 기전으로 작용하는 항산화제인 N-acetyl cystein (NAC), rotenone과 apocynin이 알도스테론에 의해 유도된 상피-중간엽 이행에 미치는 영향을 알아보았다.
결과: 정상적으로 복막중피세포에서는 MR이 발현되었다. 알도스테론은 10 nM의 농도부터 용량 의존적으로, 48시간부터 시간 의존적으로 복막중피 세포에서 E-cadherin의 발현을 감소시켰고, α-SMA의 발현을 증가시켰다. 알도스테론의 상피-중간엽 이행은 MR 길항제인 spironolactone에 의해 억제되었다. 알도스테론은 ERK, p38 MAPK을 활성화를 유도하였으나, ERK 억제제인 PD98059만이 알도스테론 유발되는 상피-중간엽 이행을 억제 시켰다. 알도스테론은 ROS 생성을 증가시켰고, NAC과 rotenone은 알도스테론에 의한 상피-중간엽 이행을 억제시켰다. 또한, NAC는 알도스테론에 의한 ERK 활성화를 차단하였다.
결론: 알도스테론은 MR 의존적 기전에 의해 복막중피세포의 상피-중간엽 이행을 유발하였다. 알도스테론에 의한 초기 ROS 생산 증가와 ERK 활성화 기전이 복막중피세포의 상피-중간엽 이행의 중요한 기전으로 사료된다. 향후 알도스테론으로 유발되는 상피 중간엽 세포 이행의 ERK 활성화 이후의 후기 병태 생리를 규명하고, 복막보존을 위한 레닌-안지오텐신-알도스테론의 억제제, ERK 길항제 및 항산화제 사용의 임상적 의의에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction = 1
• Ⅱ. Materials and Methods = 3
• A. Isolation and culture of human peritoneal mesothelial cells(HPMCs) = 3
• B. MTS assay for assessing cell proliferation = 3
• C. RT-PCR of mineralocorticoid receptor = 4
• D. Western blot analysis = 5
• E. Cell morphology and immunocytochemistry = 6
• F. DCF-DA fluorescence measurement of reactive oxygen species = 6
• G. Effect of MAPK inhibitors or anti-oxidant on aldosterone-induced EMT = 7
• H. Statistical analysis = 7
• Ⅲ. Results = 8
• A. Expression of mineralocorticoid receptor in HPMCs = 8
• B. Effect of aldosterone on proliferation of HPMCs = 8
• C. Aldosterone-induced EMT of HPMCs = 11
• 1. Morphological changes in HPMCs = 11
• 2. Expression of E-cadherin and α-SMA = 11
• D. Effect of aldosterone on ERK and p38 MAPK activation = 18
• E. Effect of MAPK inhibitors on aldosterone-induced EMT = 18
• F. Aldosterone-induced ROS generation = 22
• G. Effect of antioxidant in aldosterone-induced EMT and ERK activation = 22
• Ⅳ. Discussion = 25
• References = 31
• 국문초록 = 41