의약품 등의 광독성 시험법 탐색 연구 = Screening method for assessing phototoxicity of drug candidates

국문 초록 (Abstract)

광독성은 약물, 화학물질 등의 적용 후 빛에 의하여 노출부위에 나타나는 독성반응으로 현재 in vitro 3T3 NRU(neutral red uptake) phototoxicity assay(OECD TG 432)가 유일한 광독성 평가 시험법이다. In vitro 3T3 NRU phototoxicity assay는 광조사 유·무에 따른 세포 생존율 변화로 광독성 물질을 검색하는 시험법으로 실험방법이 간단하다는 장점이 있다. 하지만 본 시험법에서 양성으로 판정된 물질의 85%가 in vivo phototoxicity assay에서 음성으로 판정되는 단점이 있어 이를 보완할 수 있는 새로운 광독성 시험법 개발이 필요하다. In vitro 3T3 NRU phototoxicity assay에서는 마우스 섬유아 세포인 3T3 세포를 이용하지만 이는 광독성이 주로 나타나는 조직인 피부에서의 반응을 평가하기에는 적절하지 않다고 판단하여 피부 상피 유래 세포주인 JB6 세포주를 선정하였다. JB6세포주에 Antioxidant Response Element의 활성을 측정할 수 있는 ARE-luciferase vector를 도입한 세포주인 JB6-ARE를 구축하고 세포에 독성을 주지 않는 조사량인 5 J/㎠을 광조사량으로 선정하였다. Chlorpromazine, ketoprofen, terbinafine hydrochloride, L-histidine, sodium lauryl sulfate, hydrochlorothiazide, 4-aminobenzoic acid 총 7개의 시험물질에 대해 광독성 유무에 따른 세포생존율과 ARE 활성 변화정도로 광독성을 평가하였다. 세포생존율 변화에 따른 광독성평가 결과 5종 물질에 대해서는 in vitro 3T3 NRU phototoxicity assay와 같은 결과를 보였다. In vitro 3T3 NRU phototoxicity assay에서 위양성으로 판정된 4-aminobenzoic acid는 인체 결과와 같이 음성으로 판정되었다. Luciferase assay를 이용한 ARE 활성정도 측정을 통한 광독성시험에서는 인체에서 광독성 유발 보고가 있는 terbinafine hydrochloride를 광독성 물질로 판정하였고, in vitro 3T3 NRU phototoxicity assay에서 위음성으로 판정된 hydrochlorothiazide를 광독성 물질로 판정하였으며 in vitro 3T3 NRU phototoxicity assay 위양성으로 판정된 4-aminobenzoic acid를 비광독성 물질로 판정하였다. 또한 아직까지 표준화된 시험법이 없는 광유전독성 시험법 개발을 위해 인공피부모델에서의 DNA 손상 정도를 측정하는 시험 조건 및 시험법을 확립하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Phototoxicity is defined as a toxic response from a substance including drugs, cosmetics applied to the body which is either elicited or increased after subsequent exposure to light. The in vitro 3T3 NRU phototoxicity test (OECD TG 432) is used to identify the phototoxic potential of a test substance induced by the excited chemical after exposure to light. The test is a very simple and evaluates photo-cytotoxicity by the relative reduction in viability of cells exposed to the chemical in the presence versus absence of light. But, nearly half of the test substances show positive results in the test and about 85% of the positives turn to be negative in in vivo testing. Therefore, it is necessary to develop a new in vitro phototoxicity test. In this study, we try to develop a new in vitro phototoxicity test using ARE-luciferased transfected JB6 cell (JB6-ARE). After established JB6-ARE cell line, we evaluated radiation sensitivity of the cell for selecting radiation dose. A dose of 5 J/㎠ was determined to be non-cytotoxic to JB6-ARE cells and sufficiently potent to excite chemicals to elicit phototoxic reaction. We evaluated phototoxicity of 7 test substances such as chlorpromazine, ketoprofen, terbinafine hydrochloride, L-histidine, sodium lauryl sulfate, hydrochlorothiazide, 4-aminobenzoic acid by measuring cytotoxicity and luciferase activity. In cytotoxicity assay using JB6-ARE cell, results of 5 test substances were same with the results of in vitro 3T3 NRU test. 4-aminobenzoic acid, false positive in in vitro 3T3 NRU phototoxicity assay, determined non-phototoxicity substance in this test. Also, results of luciferase assay using JB6-ARE cell were same with the results of in vivo tests. These results showed this test using JB6-ARE cell have highly predictivity and sensitivity compared to in vitro 3T3 NRU phototoxicity assay. In addition, we established Comet assay in human 3D culture skin models to evaluate photogeneotoxicity of test substances and performed photogenotixicity test of 4 test substances.